Проточная цитофлуориметрия что это
Принцип метода проточной цитометрии
1 Описание метода
Проточная цитометрия (другое название проточная цитофлюориметрия, Flow cytometry) – это измерение химических и физических свойств клеток по мере того, как клетки “протекают” одна за одной через точку интеграции, которой наиболее часто является лазер. Поскольку клетки рассеивают лазерный свет в различных направлениях, то свойства клеток, такие как их относительный размер и сложность структуры цитоплазмы, могут быть измерены. В цельной крови человека лимфоциты, моноциты, и гранулоциты могут быть различимы друг от друга просто потому, что рассеивают лазерный свет различным образом.
Рис. 1 Типичный профиль светорассеяния лизированной цельной крови
Большинство современных проточных цитометров могут измерять внешние клеточные свойства (экспрессию маркеров клеточной поверхности) или экспрессию внутриклеточных маркеров, содержание нуклеиновых кислот, активность ферментов и многое другое. Чтобы исследовать эти клеточные особенности, используются флуоресцентные реагенты, такие как антитела, конъюгированные с флуорохромом. Эти реагенты имеют характерные свойства светоизлучения, так что они могут быть обнаружены отдельно в различных параметрах флуоресценции.
Уникальным атрибутом проточной цитометрии является то, что флуоресценция на клеточном уровне или уровне частиц может быть измерена очень быстро. Когда флуоресцентно меченные клетки или частицы проходят через луч света, флуоресцентные зонды возбуждаются. Обнаружение испускаемого света и, в конечном счете, определенных клеточных свойств происходит со скоростью 10000 событий / секунду.
Рис.2 Спектры возбуждения и испускания для флуорохромов VioBlue®, FITC, and APC.
Проточная цитометрия используется как в клинических, так и в фундаментальных исследованиях: иммунология, трансплантация, гематология, неврология, исследования стволовых клеток, онкология, клеточная биология, молекулярная биология, разработка лекарственных препаратов, системная биология, морская биология, микробиология, вирусология и многие другие. Клинические исследования включают, в частности, диагностику in vitro, исследования в контексте испытаний или мониторинг пациентов после лечения. Некоторые клиники также используют проточную цитометрию для характеристики клеток донора и реципиента перед трансплантацией, чтобы снизить риск побочных эффектов после трансплантации.
2 Примеры применения проточной цитометрии
3 Принцип работы проточного цитометра
Проточный цитометр, например MACSQuant от Miltenyi Biotec, основан на системе, объединяющей флюидику, оптику и электронику.
3.1 Система флюидики
Гидродинамическая фокусировка используется для выравнивания и перемещения клеток или частиц через луч лазера. Жидкость протекает с постоянным давлением через проточную кювету. Клетки вводятся в середину потока обтекающей жидкости. По принципу ламинарного потока образцы клеток и обтекающая жидкость движутся в одном направлении, но остаются разделенными. Перепад давления между обтекающей жидкостью и образцами клеток определяет, насколько широк поток пробы по мере ее прохождения через проточную ячейку. Лазеры возбуждают флуоресцентно меченные клетки или частицы по отдельности, затем измеряются флуоресценция и светорассеяние.
Рис.3 Иллюстрация гидродинамической фокусировки прибора MACSQuant®
В исследованиях с применением проточной цитофлюориметрии, которые требуют очень высокого разрешения определенных популяций клеток, например, для анализа клеточного цикла, низкая скорость жидкости рекомендуется для генерирования узкого потока образца. Для применений в обычном иммунофенотипировании, любая скорость жидкости является подходящей. Однако важно, чтобы настройка скорости событий прибора не превышала 10000 событий в секунду для любой из скоростей потока.
3.2 Оптическая система
3.2.1 Фильтры и зеркала
После возбуждения лазером флуоресцентные реагенты, связанные с клетками или частицами, излучают свет, который обнаруживается в соответствии с их конкретным диапазоном длин волн. При использовании комбинации флуоресцентных красителей эти реагенты должны иметь отличающиеся спектры излучения. В системах MACSQuant используются различные оптические фильтры и дихроичные зеркала для направления света с определенной длиной волны на соответствующие флуоресцентные детекторы. Такое расположение создает так называемые каналы флуоресценции.
Различные типы фильтров определяют, какие длины волн могут входить в каналы флуоресценции. По своим оптическим свойствам они относятся к коротковолновым пропускающим, длинноволновым пропускающим, и полосовым светофильтрам. Проточные цитометры MACSQuant используют длинноволновые пропускающие и полосовые светофильтры.
Рис.4 Оптические фильтры
Иллюстрация функции длинноволновых пропускающих (Longpass; LP), коротковолновых пропускающих (Shortpass; SP) и полосовых (Bandpass; BP) фильтров. Длинноволновые пропускающие фильтры блокируют свет до определенной длины волны, тогда как коротковолновые пропускающие фильтры пропускают свет до определенной длины волны. Полосовые фильтры пропускают свет в определенном диапазоне длин волн.
Длинноволновые пропускающие фильтры обозначаются буквами LP и конкретным числом, например, LP 750. Это означает, что свет с длинами волн 750 нм и более может проходить через фильтр. Свет всех других длин волн будет заблокирован. Коротковолновые пропускающие светофильтры имеют аналогичное обозначение, например, SP 500. В этом случае свет с длинами волн 500 нм и меньше может проходить, тогда как оставшийся свет будет блокирован. Полосовые фильтры пропускают свет с определенным диапазоном длин волн. Полосовые фильтры обозначаются через буквы BP, за которыми следуют два числа. Первое число представляет собой среднюю точку диапазона длин волн. Второе число указывает диапазон длин волн в нм, который может пройти. Таким образом, свет, который может проходить через фильтр BP 525/50, находится в диапазоне от 500 до 550 нм.
Дихроичные зеркала, по существу, выполняют ту же функцию, что и фильтры, но ориентированы под углом 45 ° к пути света, тогда как фильтры ориентированы перпендикулярно пути света. Свет, который не может пройти через дихроичное зеркало, отклоняется под углом 90 ° к другому детектору света.
Оптические системы проточных цитометров MACSQuant сочетают в себе три лазера, различные фильтры и зеркала, что дает до 14 отдельных каналов флуоресценции и два канала рассеяния.
3.2.2 Фотонные детекторы – фотоэлектронные умножители (PMTs)
Путь света определенных длин волн, то есть флуоресцентных каналов, контролируется фотоэлектронными умножителями (ФЭУ). ФЭУ усиливают флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорохромом, связанным с клеткой или частицей, и генерируют электрический ток.
Величина усиления зависит от напряжения, приложенного к каждому ФЭУ. Когда напряжение увеличивается, усиление обнаруживаемой флуоресценции также увеличивается, что приводит к более высокой средней интенсивности флуоресценции (MFI). И наоборот, когда напряжение уменьшается, усиление также уменьшается, что приводит к снижению MFI. Электрический ток, генерируемый ФЭУ, преобразуется в импульс напряжения внутри электронной системы.
3.3 Электроника
Электронная система проточного цитометра преобразует световые сигналы в пропорциональные электронные сигналы (импульсы напряжения), оцифровывает сигнал в соответствии с разрядностью аналого-цифрового преобразователя (АЦП) и взаимодействует с компьютером для передачи данных.
Преимущества цифровых проточных цитометров включают в себя:
Рис.5. Импульс напряжения
Когда клетка проходит сквозь луч лазера, прикрепленный флуорохром начнет флуоресцировать. Этот свет обнаруживается ФЭУ и запускает генерацию импульса напряжения. Когда клетка полностью входит в луч лазера, флуоресценция достигает пика излучения, что приводит к наибольшему пику импульса напряжения. Наконец, когда клетка покидает лазерный луч, обнаруживаемая флуоресценция уменьшается, импульс напряжения пропадает.
Импульс напряжения характеризуется его высотой (интенсивностью сигнала), шириной (интервалом времени) и площадью (излучаемая флуоресценция при прохождении клетки через лазерный луч).
Далее аналоговые сигналы преобразуются в цифровые сигналы для отображения данных в соответствии с разрядностью АЦП. Системы MACSQuant имеют 16-битный АЦП для всех параметров. Для площади импульса применяются дополнительные вычисления с 18-битной обработкой. Это означает, что для измерений площади импульса сигнал разлагается на более чем 253 000 частотных полос. Это позволяет использовать для отображения данных логарифмическую шкалу вплоть до пяти порядков.
4 Визуализация данных проточной цитометрии
Для визуализации данных значения каждого измеренного оптического параметра могут быть нанесены на график различными способами. Эти графики могут быть одномерными (гистограммы) или двумерными (точечные диаграммы).
4.1 Одномерные графики — гистограммы
Одномерные графики позволяют визуализировать один оптический параметр события (флуоресценции или рассеяния света). Для каждого события значения интенсивности сигнала каждого измеренного параметра сохраняются в файле данных. Когда события начинают накапливаться, генерируется «кривая», которая описывает распределение измеренных событий в соответствии с интенсивностью их сигнала.
Рис.6 Гистограмма, показывающая интенсивность флуоресценции в зависимости от количества событий
Интенсивность нанесенных на график сигналов увеличивается слева направо, т.е. клеточные популяции слева показывают меньшую интенсивность сигнала, чем популяции справа.
Одномерная гистограмма показывает распределение интенсивности флуоресценции.
4.2 Двумерные диаграммы — точечные диаграммы
Точечные диаграммы позволяют визуализировать два оптических параметра на одном графике. Положение события определяется двумя значениями, то есть интенсивностями сигнала для оптических параметров, отображаемых на осях x и y. Когда все события нанесены на график, события с аналогичными значениями интенсивности накапливаются в кластерах, которые могут представлять определенные клеточные популяции.
Рис.7 Точечная диаграмма, отображающая интенсивность двух параметров флуоресцентных сигналов
Двумерные точечные диаграммы позволяют одновременно визуализировать два оптических параметра.
На этом точечном графике клетки анализировали с использованием антител, конъюгированных с флуорохромами FITC и PE. График показывает клеточные популяции, которые являются либо отрицательными по обоим параметрам (нижний левый квадрант, LL), либо положительными по одному параметру (верхний левый (UL) и нижний правый (LR) квадранты), либо положительные по обоим параметрам (верхний правый квадрант, UR).
4.3 Двумерные диаграммы — диаграммы плотности
Диаграммы плотности отображают два параметра в виде распределения по частоте событий подобно точечной диаграмме, где каждой клетке соответствует точка. Кроме того, этот тип диаграмм изображает распределение клеток внутри популяции, характеризующейся очень высокой плотностью событий.
Рис.8 Диаграмма плотности
Диаграмма плотности показывает распределение клеток внутри популяции.
На этом графике плотности красный цвет представляет наибольшую плотность событий в клеточной популяции. С уменьшением плотности цвет переходит от желтого через зеленый к синему.
5 Источники
4 «Guide to Flow Cytometry» — Dako, Sonja Wulff, Colorado, USA
Проточная цитометрия в диагностике лимфопролиферативных заболеваний
Заболеваемость злокачественными заболеваниями кроветворной и лимфоидной ткани (гемобластозами) с каждым годом увеличивается во всем мире.
По данным канцер-регистра Республики Беларуси, за 1999-2008 гг. стандартизованные показатели заболеваемости лейкозами и лимфомами составляли 20,1 на 100 000 населения. Неуклонно увеличиваются показатели смертности больных с лейкозами и злокачественными лимфомами.
Уровень 5-летней выживаемости больных с гемобластозами остается по-прежнему низким.
Под термином «лимфома» понимают большое количество различных видов заболевания, существенно отличающихся друг от друга по своим проявлениям и подходам к их лечению. Все лимфомы разделяют на 2 большие группы: лимфома Ходжкина (ЛХ) и неходжкинские лимфомы (НХЛ). Решение о принадлежности лимфомы к группе неходжкинских лимфом или к болезни Ходжкина принимается после гистологического исследования образца биопсированной ткани. Если при микроскопическом исследовании находят специфические для болезни Ходжкина клетки Березовского-Штернберга-Рида, то ставят диагноз болезни Ходжкина. Если эти специфические клетки не находят, то лимфому относят к группе неходжкинских. Неходжкинские лимфомы (НХЛ) — гетерогенная группа злокачественных лимфопролиферативных опухолей, различающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и по прогнозу. Вероятность развития неходжкинских лимфом значительно повышается с возрастом — почти в 20 раз после 80 лет. По темпу прироста заболеваемость НХЛ опережает ЛХ. Средний возраст пациентов с НХЛ 50-60 лет.
За 170 лет изучения злокачественных НХЛ, в отличие от ЛХ, претерпели множество терминологических изменений: лимфосаркома, злокачественная лимфома, лимфобластома, ретикулосаркома, гематосаркома и др., что свидетельствует о клинико-морфологической сложности данной группы заболеваний.
Хронические лимфопролиферативные заболевания (ХЛПЗ) объединяют целую группу биологически различных опухолей, возникающих в результате накопления и/или пролиферации клональных морфологически зрелых лимфоцитов. Сама природа этих клеток делит заболевания на две большие группы: Т-клеточные и В-клеточные хронические лимфопролиферативные заболевания, внутри которых на основании клинических проявлений и опухолевого происхождения выделяют:
Иммунофенотипическая диагностика ХЛПЗ по фенотипическому профилю клеток периферической крови возможна только в двух ситуациях:
Проведение диагностического ИФТ оправдано при выявлении в периферической крови абсолютного и относительного лимфоцитоза. Пороговый уровень лимфоцитоза, при котором считается необходимым проводить диагностическое ИФТ за последние годы снизился с 10х10 9 /л [74] до 5х10 9 /л.
С начала 80-х годов ХХ века, когда развитие гибридомной технологии позволило получать моноклональные антитела любой специфичности, стало возможным нарастающее по сложности и объему информации иммунофенотипирование.
Проточная цитометрия (ПЦ) является интегральным инструментом изучения различных биологических систем с помощью регистрации флюоресценции и использования флюоресцентных красителей, способных связываться с различными компонентами клетки.
В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки по одиночке вводятся в ламинарный поток в проточной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный световой пучок, не касаясь стенок кюветы. Источником света могут быть различные лазеры, ультрафиолетовая лампа или их комбинация. Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и раскладывают на компоненты. Световые сигналы улавливаются и преобразуются в электрические импульсы фотоумножительным устройством. Далее информация обрабатывается в цифровом режиме. Величины, измеренные фотоумножителем, отображаются на гистограммах. Современные проточные цитофлуориметры позволяют одновременно измерять несколько (до восьми) параметров: рассеяние света на малые углы (до 10°), которое еще называют прямым светорассеянием (forward scattering или FSC); рассеяние света на угол 90°, т.н. боковое светорассеяние (side scattering или SSC]; интенсивность флуоресценции на разных длинах волн. Параметры светорассеяния позволяют проводить разделение клеток по размерам, форме, состоянию клеточной мембраны и характеристикам цитоплазмы.
Традиционно концентрация клеток определяется путем разделения пробы на две части и сравнение результатов анализа иммунофенотипирования, выполненного на проточном цитометре с результатами подсчета клеток на гематологическом анализаторе. Такая процедура приводит к дополнительным затратам времени, средств и мощностей лабораторного оборудования. В настоящее время на рынке имеются наборы калибровочных частиц для определения концентрации клеток непосредственно на проточном цитометре, однако их использование также связано с дополнительными затратами. Проточные цитометры являются полностью открытыми системами, что не ограничивает пользователя в выборе реагентов.
При анализе клеток, маркированных двумя, тремя или четырьмя антителами, коньюктированными с различными цветовыми метками, необходимо проводить компенсацию сигналов с флуоресцентных каналов проточного цитометра из-за перекрытия спектров эмиссии используемых красителей.
Проточная цитометрия позволяет определить долю клеток, находящихся в S-фазе и оценить степень пролиферации. С помощью ДНК-гистограмм возможно четко разделить клетки, находящиеся в G1-, S- и G2/M-фазах клеточною чикла. Совокупность информации о содержании ДНК, маркеров апоптоза и клеточной пролиферации, имеет важное значение в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний крови и солидных опухолей.
Диагностика лейкозов, лимфом в настоящее время одна из наиболее передовых областей использования проточной цитометрии. Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга обеспечивает ключевой информацией для качественной диагностики и оценки прогноза заболевания.
Трансплантация костного мозга (ТКМ) при лимфомах и лейкозах предполагает перенос стволовых мультипотентных клеток, ответственных за восстановление нормального гемо- и лимфопоэза, в противоположность гемотрансфузиям, которые дают временный эффект. Кроветворные клетки для ТКМ могут быть получены из костного мозга, периферической и пуповинной крови. Процедура ТКМ более не является экспериментальным методом, а составляет важный компонент в лечении онкологических и наследственных заболеваний. Рецептор CD34 используется как маркер полипотентных кроветворных стволовых клеток. Подсчет абсолютного числа CD34+ клеток при помощи проточной цитометрии является золотым стандартом в оценке количества кроветворных клеток.
Таким образом, проточная цитометрия имеет достаточно широкие возможности для решения различных диагностических и исследовательских задач, делая лабораторное исследование технологичным, точным и своевременным.
Широкие возможности ее применения связаны с тем, что интенсивность флюоресценции прямо пропорциональна количеству контролируемого вещества в клетке, однако при определенных условиях могут быть зарегистрированы очень малые количества флюорохрома, в том числе меньше 1000 молекул на клетку. Некоторые флюоресцентные красители могут менять параметры флюоресценции внутри живых клеток и превращаться из нефлюоресцирующих во флюоресцирующие под воздействием определенных ферментов, изменять спектр флюоресценции под действием ионов кальция, их можно применять при конструировании молекулярных зондов.
Возможности ИФТ в прогнозировании течения и исхода онкогематологических заболеваний во многом определяются адекватным набором антител для первичной диагностики.
Развитие технологий в области мультипараметрического анализа, гейтирования по CD45, автоматизированного анализа кластеров и стандартизации аппаратуры достаточно быстро перевело проточные цитометры из разряда приборов научного использования в рутинное оборудование клиник и сделало саму ПЦ стандартом лабораторной диагностики в области иммунофенотипирования клеток. Выявление молекул, тем или иным образом интегрированных с клеточной мембраной, является только одной из сфер применения ПЦ, но именно она имеет максимальное диагностическое значение.
Все большее количество определяемых параметров позволяет изучать все более сложные фенотипы нормальных и злокачественных лейкоцитов, и, следовательно, все более тонкие аберрации, выделяющие опухолевую клетку в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга. Эти возможности и превратили проточную цитометрию в метод выбора при определении линейной принадлежности и уровня созревания злокачественных клеток при острых лейкозах и лимфомах.
Виды биологического материала, направляемого на тестирование для выявления лейкоза/лимфомы и определения их природы, достаточно разнообразны: периферическая кровь, аспират костного мозга, трепанобиоптат, взвесь клеток лимфатического узла, ликвор, плевральная жидкость.
Мультипараметрический анализ позволяет уменьшить необходимый объем образца, время пробоподготовки и фактического анализа, сокращая тем самым путь от получения биологического материала до клинического результата – иммунофенотипического диагноза. Проточная цитометрия предоставляет три типа данных:
Последующая экспертная оценка всей совокупности данных, ведущая к установлению диагноза является дополнительным источником вариабельности окончательных результатов за счет выбора метода оценки антигенной экспрессии и критериев интерпретации первичных данных.
Мультипараметрические возможности оценки клеток стали использовать для выявления фенотипических аберраций лейкозных клеток с максимальной вероятностью специфических генетических поломок для подтверждения которых необходима молекулярная диагностика. Известно, что среди пациентов с идентичным, в том числе нормальным, кариотипом или генетическими аберрациями прогрессия заболевания различна и не всегда предсказуема, что требует поиска дополнительных критериев информации, которыми могут оказаться данные ИФТ. При невозможности получить метафазные пластинки выявление хромосомных аберраций может быть осуществлено с помощью молекулярных проб и определения профиля экспрессии генов в злокачественных клетках. Немногочисленные работы применения микроэррей-технологии при острых лимфобластных лейкозах показали перспективность этого направления при поиске новых прогностических признаков генетических нарушений и прогноза заболевания. К сожалению, молекулярно-биологические исследования не являются рутинными для многих, в том числе специализированных, клиник, а там, где осуществляются, получение информации значительно дистанцировано во времени от получения биологического материала. С клинической точки зрения, это, скорее, подтверждающие (или отрицающие) диагноз исследования, но не определяющие его.
Для проведения иммунофенотипической диагностики лейкозов и лимфом необходимо выделить клетки, являющиеся субстратом заболевания. До появления методических возможностей работы с цельной кровью (костным мозгом) при диагностике гемобластозов только использование градиентного центрифугирования создавало возможность анализа трансформированных клеток, патологических лимфоцитов и бластов. За такое увеличение относительного содержания опухолевых клеток приходилось платить потерей возможности оценить клеточный состав образца в целом. Поэтому, если еще в середине 90-х годов ХХ века выделение мононуклеаров на градиенте плотности расценивалось как обязательный этап пробоподготовки, то позднее пришли к однозначному предпочтению лизиса при работе с образцами онкогематологических пациентов.
Для определения возможности проведения ИФТ необходима информация о количестве лейкозных бластов в образце, так как при их низком содержании (менее 20%) фенотипический профиль бластной популяции может быть оценен неправильно. Принято считать, что относительное содержание бластов указано в миелограмме, сопровождающей костный мозг, направляемый на ИФТ. Однако на практике нередко материал стернальной пункции одновременно направляется морфологу для получения детальной миелограммы и иммунологу для определения варианта лейкоза, т.е. клеточность образца неизвестна. Кроме того, возможное разведение костного мозга периферической кровью может серьезно влиять на конечный результат исследования. Следствием этого оказывается необходимость вносить специфические антитела в избытке, а не из расчета на количество клеток. Для определения уровня бластоза при ПЦ необходимо средствами программного обеспечения отделить собственно клетки от дебриса и сдвоенных клеток, которые могут в разном количестве присутствовать в анализируемом образце и особенно часто выявляются при хронических лимфопролиферативных заболеваниях.
Основной задачей ИФТ является получение информации, которая позволяет установить факт наличия гемобластоза и его иммунологический вариант, а последующая их интерпретация предполагает интегральный анализ ИФТ и других клинических и лабораторных данных.
Литература