Пробоподготовка сыворотка крови что это
Пробоподготовка сыворотка крови что это
В последние годы все больше публикаций посвящено анализу качества научных работ, в частности проблеме низкой воспроизводимости результатов исследований [1]. В связи с этим актуальны усилия, направленные на повышение стандартизации преаналитического этапа научных исследований, а также подробное описание всех деталей этого этапа.
Значение контроля качества образцов
Контроль качества (КК) биообразцов, применяемых для научных исследований, имеет принципиально важное значение для обеспечения достоверности получаемых данных. Однородность процедур сбора, транспортировки и условий хранения биообразцов имеет решающее значение для обеспечения качества многоцентровых научных исследований.
Важным и эффективным инструментом для такой стандартизации и сохранения большого количества биологических образцов является создание биобанка. Биобанк — структура для сбора, хранения и поставки биологических образцов и связанных с ними данных, которая следует стандартным операционным процедурам и предоставляет материалы для научного использования [2].
Все биообразцы подвергаются процедурам сбора, транспортировки, пробоподготовки и хранения. Процедуры в биобанке выполняются строго по принятым стандартам, в противном случае может снизиться качество биообразцов. Забор биоматериала осуществляется медицинским персоналом по стандартной методике в соответствии с п. 3.2 ГОСТ 53079.4 — 2008 [3]. Далее биоматериал вместе с необходимыми документами транспортируется в биобанк, где осуществляется пробоподготовка и регистрация полученного биоматериала (рис. 1). 
Рис. 1. «Жизненный цикл» биообразцов.
Таблица 1. Диагностические инструменты КК
Таблица 2. Пригодность биологического материала для исследований в различных областях
Пробоподготовка крови включает центрифугирование и дальнейшее аликвотирование сыворотки или плазмы крови. В соответствии со стандартом необходимо выполнить центрифугирование крови не позднее, чем через 1 ч после забора. Затем аликвотированный биоматериал помещается на хранение в морозильные камеры при температуре –80 °С.
Процедуры КК предназначены для оценки данных и биообразцов, используемых в научных исследованиях. КК данных включает контроль демографической, клинической информации, точность обработки данных, в то время как КК биологических образцов включает анализы на подлинность, целостность и идентичность образцов [1]. КК биологических образцов необходим для обеспечения точной характеристики и категоризации образцов, а также для избежания ошибок в последующих исследованиях из-за внутренней неоднородности в образцах.
Процедуры КК могут осуществляться биобанком, конечным пользователем или лабораторией субподрядчиков и должны выполняться с соблюдением правил GLP (Good Laboratory Practice, Надлежащая лабораторная практика) или стандартов ISO 15189:2012 (Медицинские лаборатории — особые требования к качеству и компетентности), ISO 17025:2005 или CLIA (Clinical laboratory improvement amendments, Поправки к клиническим лабораторным улучшениям) [4—6].
Ретроспективный КК может быть применен либо к случайно выбранным образцам, либо к образцам, качество которых вызывает наибольшее сомнение. Первый подход позволяет сравнивать различные места сбора, а второй позволяет целенаправленно оценивать образцы с «наибольшим риском» [2].
Инструменты контроля качества биологических образцов
Контроль качества биологических образцов является важным элементом в научных исследованиях. В настоящее время отсутствует консенсус относительно оптимальных инструментов КК образцов (маркеры и анализы). Инструменты К.К. можно разделить на два типа: диагностические и прогностические [7].
Диагностические инструменты оценивают этапы обработки биологического образца (задержка обработки образца, время или тип фиксации, продолжительность хранения) [7]. Прогностические инструменты оценивают выполнимость и/или надежность последующего анализа на данных образцах. Это особенно важно для методов с высокой пропускной способностью, поскольку прогностические инструменты предсказывают успешную производительность метода (рис. 2) 
Рис. 2. Инструменты контроля качества биообразцов. [7].
Наиболее легко применимыми инструментами являются маркеры с известным порогом для преаналитического отклонения и известным эталонным диапазоном для аналита К.К. Было выявлено лишь несколько значимых маркеров, соответствующих этим критериям: CD40L (маркер воспаления) для оценки качества сыворотки при повышенных температурах и VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) для оценки замораживания–оттаивания сыворотки [1]. Для полной оценки качества биообразца необходимо использовать несколько маркеров КК. В статье представлены наиболее перспективные инструменты КК биологических образцов, которые были определены группой экспертов международного сообщества ISBER (International society for biological and environmental repositories) [7, 9].
Одной из задач биобанкирования является предоставление гарантии того, что образец действительно соответствует требуемым параметрам. Например, когда биобанк предоставляет биообразцы для исследований от пациентов с какими-либо заболеваниями, необходимо точно знать, возможно ли провести исследования на выявление того или иного маркера, который соответствует данному заболеванию.
Соблюдение температурных и временныˊх рамок на этапе прецентрифугирования, центрифугирования и хранения очень важно. В противном случае некоторые маркеры могут деградировать, и данные образцы станут непригодными для ряда ценных исследований. В связи с этим важны как процедуры строгой документации всего «жизненного цикла биообразца», так и процедуры КК, которые позволяют определить временныˊе характеристики этапов пробоподготовки в случае необходимости. Кроме того, при использовании биоматериала для изучения определенных заболеваний возможна оценка ряда параметров, показывающих пригодность конкретных биообразцов для исследований в данной сфере.
Далее в статье будут приведены основные известные на данный момент процедуры определения качества биообразцов сыворотки и плазмы, в том числе их пригодность для исследований в различных научно-медицинских сферах.
Сыворотка крови
Контроль качества образцов сыворотки крови по параметру времени перед центрифугированием
Рецептор трансферрина. R. De Jongh и соавт. [8, 9] показали увеличение концентрации растворимого рецептора трансферрина, измеренного методом иммуноферментного анализа (ИФА), на 90% после 8-часовой задержки прецентрифугирования, и сообщили о рефе-рентном диапазоне от 171 до 212 Ед/мл.
Аскорбиновая кислота. A. Karlsen и соавт. [10] предложили измерять показатель аскорбиновой кислоты в качестве потенциального инструмента КК сыворотки и плазмы методом хроматографии. Показано 70% снижение уровня аскорбиновой кислоты после 6-часовой задержки прецентрифугирования крови при комнатной температуре, а также 100% снижение после 3 мес хранения при –20 °С. Из клинической химии известно, что референсный диапазон составляет от 26 до 85 мкмоль/л [11].
Также можно проверить условия предварительного центрифугирования и убедиться, что образец пригоден для анализа путем измерения уровня белка IL8. Уровень IL8 выше 125 пг/мл или выше 528 пг/мл указывает на задержку перед центрифугированием при комнатной температуре, превышающей 24 ч или 48 ч соответственно [9, 14].
Контроль качества образцов сыворотки крови по параметру времени после центрифугирования. Можно проверить условия после центрифугирования и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа, измерив концентрацию sCD40L с помощью ИФА. Если концентрация sCD40L ниже 4720 пг/мл, то образец после центрифугирования выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч и более; если ниже 1693 пг/мл — в течение 48 ч и более [9].
Условия хранения. VEGF. K. Kisand и соавт. [15] недавно показали, что VEGF в сыворотке является лабильным к размораживанию—оттаиванию и длительности хранения либо при –20 °C, либо при –80 °C. При измерении VEGF с помощью ELISA после 1—6 циклов замораживания—оттаивания маркер переставал обнаруживаться. Тесты ускоренного старения и графики Аррениуса позволяют провести экстраполяцию для предсказания того, что VEGF не будет обнаружен после 11 мес хранения при –20 °C или после 4,5 года хранения при –80 °C. Контрольный диапазон VEGF, сообщаемый производителями наборов для ИФА (например «R & D Systems, Inc.», вкладыш в упаковку: Иммуноанализ Quantikine Human Total MMP7; Миннеаполис, Миннесота), составляет от 62 до 707 пг/мл в сыворотке. Однако эти результаты не были подтверждены на плазме [16].
Плазма крови ЭДТА
Контроль качества образцов плазмы крови ЭДТА по параметру времени до центрифугирования
GM-CSF, IL-1α и G-CSF. S. Ayache и соавт. [17] выполнили ИФА для изучения общего профиля хемокинов и цитокинов в плазме ЭДТА, собранной с ингибиторами протеазы или без них. Двухчасовая задержка прецентрифугирования при комнатной температуре вызвала 11–20-кратное увеличение GM-CSF, IL-1α и G-CSF в крови, собранной без ингибиторов протеазы, и 7–10-кратное увеличение тех же белков в крови, собранной с ингибиторами протеазы. Базовые контрольные уровни были зарегистрированы как 214±163 пг/мл для GM-CSF, 9,4±7,7 пг/мл для IL-1α и 119±60 пг/мл для G-CSF.
Можно проверить условия предварительного центрифугирования и убедиться, что образец пригоден для целей метаболического анализа:
а) используя ферментативный анализ LacaScore, если LacaScore ниже 5, то образец выдерживали при комнатной температуре менее 3 ч;
б) с использованием метода METANOMICS GC-MS, если показатель MxP равен или превышает 90, то образец выдерживали при комнатной температуре менее 2 ч; если в диапазоне 89—70, то в течение 2—6 ч; если ниже 70, то образец хранился при комнатной температуре более 6 ч [9].
Также можно проверить задержку перед центрифугированием и убедиться, что образец пригоден для протеомного, метаболического анализа, анализа cfDNA или ccfRNA, путем измерения концентрации IL16 с помощью ELISA. Если концентрация IL16 выше чем 313 пг/мл или выше чем 897 пг/мл, время задержки перед центрифугированием при комнатной температуре было больше чем 24 или 48 ч соответственно [9, 14].
Аскорбиновая кислота. Одним из методов проверки времени задержки перед центрифугированием является измерение аскорбиновой кислоты методом хроматографии, также как в случае сыворотки крови (см. раздел 2.1.1.).
Контроль качества образцов плазмы крови ЭДТА по параметру времени после центрифугирования. Можно проверить условия после центрифугирования и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа:
а) путем измерения концентрации sCD40L с помощью ИФА — если концентрация ниже 185 пг/мл, пробу выдерживали при комнатной температуре более 48 ч;
б) измерение пептида компонента 3 комплемента (C3f) и компонента 4 комплемента (C4) с использованием MALDI-TOF-MS или LC-ESI-MS; если возможно обнаружить пик для C4 при 1896,1 m/z и пик для C3f при 2021,1 m/z, образец выдерживали при комнатной температуре более 4 ч [9].
Витамин Е. M. Ockè и соавт. [18] сообщили, что содержание витамина Е в плазме ЭДТА уменьшилось более чем на 90%, когда плазма хранилась более 24 мес при –20 °C. Аналитическим методом была высокоэффективная жидкостная хроматография. Референсный диапазон составляет от 19 до 31 мкмоль/л.
Цитратная плазма
Контроль качества образцов цитратной плазмы по параметру времени перед центрифугированием. Можно проверить время до этапа центрифугирования и убедиться, что образец пригоден для анализа белков, путем измерения активности фактора VIII (фактор свертывания крови): активность белка С с использованием анализа активности коагуляции. Если активность ниже 50 МЕ/дл, образец выдерживали при 4 °C более 24 ч [9].
Также можно проверить задержки перед центрифугированием и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа, измеряя концентрацию интерлейкина-8 (ИЛ-8) с помощью ИФА. Если концентрация ИЛ-8 превышает 21,5 пг/мл, время предварительного центрифугирования при комнатной температуре превышает 48 ч [9].
Контроль качества образцов цитратной плазмы по параметру времени после центрифугирования. Можно проверить время, прошедшее после центрифугирования до замораживания, и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа следующим методом: измерение пептида компонента 3 комплемента (C3f) и компонента 4 комплемента (C4) с использованием MALDI-TOF-MS или LC-ESI-MS. Если возможно обнаружить пик для C4 при 1896,1 m/z и пик для C3f при 2021,1 m/z, образец выдерживали при комнатной температуре более 4 ч. Использование таких образцов для протеомного анализа невозможно [9].
Условия хранения. Проверку условий хранения цитратной плазмы можно осуществить методом измерения активности белка S с помощью анализа активности коагуляции: если активность ниже 50%, образец хранился при –80 °C более 9 лет [9].
Пригодность биологического материала для исследований в различных областях
Гемолиз. Можно проверить наличие Hb-загрязнения и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа или анализа на основе микроРНК с помощью ELISA или спектрофотометрии. Если концентрация Hb выше 50 мг/л, произошел гемолиз, проба считается загрязненной Hb [9].
Воспаление. Проверить наличие маркера воспаления в образце можно, измерив концентрацию С-реактивного белка (СРБ) с помощью ИФА или нефелометрии. Если концентрация выше 10 мг/л, образец показывает наличие воспаления [9].
Пригодность для исследования сердечно-сосудистых заболеваний. Для установления пригодности для исследований необходимо измерить:
а) уровень BNP, NT-proBNP, используя ИФА;
б) уровень ANFPTL3, используя ИФА или электрохемилюминесцентный иммуноанализ;
в) уровень СК-MB и ET-1, используя ИФА;
г) ММР-3 и уровень ММР-9 с использованием ИФА;
д) уровень тропонина I и тропонина Т с использованием ИФА или электрохемилюминесцентного иммуноанализа.
Эти белки должны выявляться, чтобы образец можно было использовать в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний [9].
Пригодность для исследования заболеваний печени. Необходимо измерить уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ) с помощью флюороиммуноанализа. АЛТ должен быть обнаружим, чтобы проба подходила для исследования заболеваний печени [9].
Пригодность с целью исследования аутоиммунитета. Для исследований необходимо определить уровень фактора некроза опухоли-α (TNF-α) с помощью чувствительного ИФА. TNF-α должен быть обнаружим, чтобы образец соответствовал критериям исследования аутоиммунитета [9].
Пригодность для исследований в области эндокринологии и диабета. Необходимо измерить уровень пептида инсулина C и инсулина как предшественника фактора роста II с помощью ИФА, флюороимуноанализа или радиоиммуноанализа; уровень альдостерона и соматомедина С с помощью ИФА. Эти белки должны быть обнаружены, чтобы образец соответствовал исследованиям в области эндокринологии [9].
Пригодность для исследования воспаления и иммунологии. Необходимо измерить уровень комплемента C с помощью нефолометрии или энзиматического иммуноанализа; уровень ICAM-1и TNF-α с помощью энзиматического иммуноанализа. Эти белки должны быть обнаружены, чтобы образец соответствовал исследованиям в области воспаления и иммунологии [9].
Пригодность с целью исследования в онкологии. Для проверки необходимо: использовать ИФА M65 EpiDeath; измерить уровень VCAM-1 с помощью ИФА. Эти белки должны обнаруживаться, чтобы образец соответствовал исследованиям в области онкологии [9].
Пригодность для целей исследований в области заболеваний опорно-двигательного аппарата. Необходимо измерить уровень MID-остеокальцина, остеокальцина и кальцитонина, а также С-терминального телопептида и коллагена типа 1, интактного паратиреоидного гормона (ПТГ) с помощью ИФА или электрохемилюминесцентного иммуноанализа. Эти белки должны быть обнаружены для того, чтобы образец мог быть использован в исследованиях в области заболеваний опорно-двигательного аппарата [9].
Пригодность для исследования в области питания. Необходимо измерить уровень витамина B12 с помощью электрохемилюминесцентного иммуноанализа. Витамин B12 должен быть обнаружим, чтобы образец соответствовал критериям исследования питания [9].
Пригодность для исследования нейродегенеративных заболеваний. Для установления пригодности для подобных исследований необходимо измерить уровень амилоида Aβ42 с помощью ИФА; нейрон-специфический уровень энолазы с помощью иммуноанализа Kryptor, ИФА или электрохемилюминесцентного иммуноанализа. Эти белки должны обнаруживаться, чтобы образец соответствовал исследованиям нейродегенеративных заболеваний [9].
Контаминация тромбоцитами. Проверить наличие тромбоцитов и убедиться, что образец пригоден для анализа на микрочастицы или ccfRNA, можно, выполнив подсчет клеток. Если концентрация тромбоцитов ниже 10 4 /мл, считается, что отсутствует значимая контаминация образца плазмы тромбоцитами [9].
Активация тромбоцитов. Также можно проверить активацию тромбоцитов и убедиться, что образец пригоден для исследования биомаркеров, на которые влияет активация тромбоцитов путем измерения концентрации β-тромбоглобулина (βTG) с помощью ELISA. Если концентрация выше 200 нг/мл, происходит активация тромбоцитов [9].
Гемолиз. Проверить наличие загрязнения Hb и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа или анализа микроРНК, можно, выполнив ELISA или спектрофотометрию. Если концентрация Hb выше 20 мг/л, произошел гемолиз и проба считается загрязненной Hb [9].
Воспаление. Проверить выраженность воспаления в образце можно, измерив концентрацию СРБ с помощью ИФА или нефелометрии. Концентрация выше 10 мг/л свидетельствует о воспалении [9].
Пригодность для исследования сердечно-сосудистых заболеваний. Для установления пригодности для исследований необходимо измерить уровень тропонина I и тропонина Т, используя ИФА или электрохемилюминесцентный иммуноанализ; уровень вазоактивного интестинального пептида (VIP), используя ИФА.
Эти белки должны быть обнаружены, чтобы образец соответствовал исследованиям сердечно-сосудистых заболеваний [9].
Пригодность для исследования липидного обмена. Для проверки можно измерить уровни активности белка-переносчика CETР с помощью флюороиммуноанализа. CETP должен быть обнаружим, чтобы проба соответствовала требованиям для исследования липидного обмена/липидомного анализа [9].
Пригодность для исследования аутоиммунитета. Для данного исследования можно измерить TNF-α с помощью чувствительного ИФА. TNF-α должен быть обнаружим, чтобы образец соответствовал критериям исследования аутоиммунитета [9].
Пригодность для целей исследований в области эндокринологии, включая диабет. Для оценки пригодности можно измерить уровень глюкагоноподобного пептида 1, используя ИФА или радиоиммуноанализ; уровень аденокортикотропного гормона, используя электрохемилюминесцентный иммуноанализ или радиоиммуноанализ; уровень альдостерона и соматомедина С, используя ИФА.
Эти белки должны быть обнаружены, чтобы образец соответствовал исследованиям в области эндокринологии, включая сахарный диабет [9].
Пригодность для исследования воспаления и иммунологии. Для проверки можно измерить: уровни комплемента С с помощью нефолометрии или энзиматического иммуноанализа; уровень ICAM-1 с помощью энзиматического иммуноанализа. Эти белки должны быть обнаружены, чтобы образец соответствовал исследованиям воспаления и иммунологии [9].
Пригодность для целей исследований заболеваний опорно-двигательного аппарата. Необходимо измерить уровень C-терминального телопептида и коллагена I типа, используя ИФА или электрохемилюминесцентный иммуноанализ. Эти белки должны обнаруживаться, чтобы образец мог быть использован для исследований в области заболеваний опорно-двигательного аппарата [9].
Пригодность для исследования нейродегенеративных заболеваний. Для установления пригодности для исследований можно измерить уровень амилоида Aβ42 с помощью ИФА. Aβ42 должен быть детектируемым, чтобы проба подходила для исследования нейродегенеративных заболеваний [9].
Пригодность для исследования коагуляции (только для цитратной плазмы). Для проверки можно измерить уровень антифактора Ха и фибриногена; фрагменты протромбина 1 и 2 и активность ингибитора активатора плазминогена типа 1 или антиген с использованием ИФА; анализ образования тромбина с использованием флюороиммуноанализа; антиген ТРА с использованием ИФА. Эти белки должны обнаруживаться, чтобы образец соответствовал необходимому качеству для изучения процесса коагуляции [9].
Заключение
Высокое качество биоматериалов и связанных с ними данных имеет важнейшее значение для достижения надежных и воспроизводимых научных результатов. Результаты исследований, приведенные в данном обзоре, свидетельствуют об изменении качества биоматериала при нарушении правил на любой стадии преаналитического этапа. Для обеспечения необходимого качества образцов сыворотки и плазмы крови могут использоваться специальные методы целенаправленного К.К. Такой К.К. может осуществляться как на этапе поступления биообразцов в биобанк, так и на этапе непосредственного применения биоматериала, пуска в работу в рамках конкретного научного проекта. Процессы сбора, обработки, хранения и выдачи биоматериалов должны быть проведены и задокументированы по стандартам. Именно выполнение стандартов всех стадий преаналитического этапа гарантирует должное качество биообразцов. При необходимости (в случае сомнения в качестве биоматериала) следует использовать методы оценки качества. В настоящее время процесс поиска маркеров качества биообразцов продолжается в ведущих биобанках мира. Наиболее значимые результаты в этой области получают специалисты отдела КК биобанка Люксембурга (IBBL) [19].
Наличие биобанка в структуре научного процесса обеспечивает жесткое соблюдение стандартизированных условий проведения преаналитического этапа и играет ключевую роль в контроле и гарантии качества биообразцов, предназначенных для научных исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflict of interest.
Пробоподготовка сыворотка крови что это
Кафедра лабораторной диагностики Института последипломного образования Башкирского государственного медицинского университета Минздрава России
ООО «Адвенсум», Москва
Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва
компания BD Life Sciences, Москва
Мытищинская Городская Клиническая больница, г. Мытищи
клинико-диагностическая лаборатория ФГБУ «ФЦ ССХ» Минздрава России, Красноярск
Особенности взятия и пробоподготовки биоматериала для лабораторных исследований при неотложных состояниях
Журнал: Лабораторная служба. 2015;4(3): 19-24
Гильманов А. Ж., Кишкун А. А., Годков М. А., Сашков В. А., Зубкова Н. В., Грищенко Д. А. Особенности взятия и пробоподготовки биоматериала для лабораторных исследований при неотложных состояниях. Лабораторная служба. 2015;4(3):19-24.
Gil’manov A Zh, Kishkun A A, Godkov M A, Sashkov V A, Zubkova N V, Grischenko J A. Main rules for blood and urine sampling in emergency departments. Laboratory Service. 2015;4(3):19-24.
https://doi.org/10.17116/labs20154319-24
Кафедра лабораторной диагностики Института последипломного образования Башкирского государственного медицинского университета Минздрава России
Рассмотрены основные подходы к организации преаналитического этапа в отделениях неотложной помощи. Детально описана процедура взятия биологических образцов для проведения лабораторных исследований (венозной и артериальной крови, мочи) на основе современных мировых стандартов и с учетом специфики отделений неотложной помощи.
Кафедра лабораторной диагностики Института последипломного образования Башкирского государственного медицинского университета Минздрава России
ООО «Адвенсум», Москва
Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва
компания BD Life Sciences, Москва
Мытищинская Городская Клиническая больница, г. Мытищи
клинико-диагностическая лаборатория ФГБУ «ФЦ ССХ» Минздрава России, Красноярск
Пробоподготовка и транспортировка биоматериала для лабораторных исследований при неотложных состояниях имеют целый ряд нюансов в силу требуемой срочности диагностики. К ним относятся особенности терапии пациентов реанимационных отделений, катетеризация вен и мочевого пузыря, а также частота взятия биологического материала на исследование в течение суток. Эти факторы наряду с рядом других (выбор типа биологического материала для исследования, метод его взятия, правильная и своевременная доставка в лабораторию) могут оказывать существенное влияние на качество результатов анализов.
Однако преаналитическому этапу не всегда уделяется должное внимание со стороны врачей-клиницистов и среднего медицинского персонала отделений неотложной помощи. Вместе с тем без глубокого понимания важной роли этих факторов в обеспечении качества результатов анализов невозможно улучшить качество диагностики и лечения больных, находящихся в критических состояниях. Исследования многих лечебно-профилактических учреждений показывают, что вследствие лабораторных ошибок до 6% пациентов могут получать неправильное лечение, которое может привести к ухудшению состояния здоровья, а примерно 19% больным назначаются ненужные дополнительные исследования [7], подразумевающие удлинение сроков лечения и пребывания их в стационаре. Именно поэтому в отделениях неотложной помощи необходимо уделять особое внимание условиям и способам взятия, времени хранения и доставки образцов биоматериала для исследований.
Так, одной из наиболее распространенных манипуляций в практике отделения неотложной помощи является катетеризация периферических и центральных вен. Каждый год в мире врачами устанавливается свыше 500 миллионов периферических и более 15 миллионов центральных венозных катетеров [2]. Катетеры широко используются в ситуациях, когда требуется частое или постоянное внутривенное введение лекарственных веществ [1]. Наряду с введением лекарственных препаратов через катетеры часто забирают образцы венозной крови для их последующего лабораторного исследования. Это особенно актуально при многократном взятии крови у пациентов реанимационных отделений, пациентов с низким давлением и спавшимися венами, а также у больных на гемодиализе и детей, поскольку при этом не нужно каждый раз пунктировать вену [11].
Частота взятия крови из катетера в реальных клинических ситуациях может сильно различаться. Согласно руководству А.А. Кишкуна [6], во избежание инфекционных осложнений кровь из катетера для клинико-лабораторных исследований рекомендуется брать не чаще 1 раза в день. Однако у пациентов отделений реанимации кровь зачастую приходится брать несколько раз в сутки, в ряде случаев — ежечасно. При этом для обеспечения доступа в сосудистое русло могут использоваться периферические и центральные венозные или артериальные катетеры, а также катетеры в центральных венах, введенные через периферические вены. Определение вида катетера для конкретного пациента зависит от вида оказания медицинских манипуляций и объема медицинской помощи. Для лабораторных исследований кровь можно брать как из центральных, так и из периферических сосудистых катетеров.
Существуют два основных способа взятия крови из катетера.
Способ трех шприцев. Первым шприцем из катетера отсасывается и отбрасывается небольшое количество крови (3—5 мл), смешанной с последним вводившимся через катетер раствором или гепарином; вторым шприцем отбирается кровь на лабораторное исследование; третьим — катетер заполняется раствором гепарина («гепариновый замок»). Одной из основных проблем при использовании этого способа является частый гемолиз в пробах, вызванный механическим «шоком» клеток крови при двукратном прохождении под давлением через узкую иглу. Гемолиз в образце представляет реальную опасность для пациента, поскольку может быть причиной ложных результатов тестов (искажение параметров коагуляции, завышение активности ЛДГ, АЛТ, АСТ, КК, уровня калия, сывороточного железа, а также некоторых гормонов, например, β-ХГЧ) и, соответственно, ошибок в диагностике и лечении. Это особенно критично в операционных и в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), так как ведет к необходимости повторного взятия крови и потере времени.
Использование люэр- или люэр-лок-адаптера. В последние годы широкое распространение получают устройства безыгольного доступа, представляющие собой насадку с люэровской канюлей (адаптером), присоединяющейся к периферическому внутривенному катетеру. Люэр-адаптер с внутренней иглой вначале ввинчивается в держатель пробирки, а затем своей «люэровской» частью герметично вставляется в установленный ранее внутривенный катетер. Люэр-лок-адаптер, интегрированный в держатель, сразу присоединяется к внутривенному катетеру при помощи резьбового крепления. Преимуществом использования этих устройств является возможность взятия крови из катетера без использования иглы и шприца — напрямую в вакуумную пробирку. Это позволяет снизить риск гемолиза и нарушения соотношения крови и реагента, находящегося в пробирке, а также обеспечивает дополнительную защиту медицинского персонала от уколов иглой.
Дискуссионной остается возможность взятия крови из внутривенного катетера для исследования параметров гемостаза. Даже небольшое количество гепарина, которым заполняют катетер для предотвращения его тромбирования («гепариновый замок»), при попадании в образец крови может дать картину ложной гипокоагуляции по тестам АЧТВ, ПВ и ТВ. В соответствии с ГОСТ Р 53079.4−2008 из катетеров, обработанных гепарином, нельзя брать кровь для исследования свертывающей системы [12]. В других литературных источниках допускается взятие крови из катетера для исследования гемостаза, но при условии отбрасывания первых 5—10 мл крови, содержащих антикоагулянт или его следы. В любом случае, если для исследования свертывающей системы кровь берут из катетера, на бланке следует сделать пометку для предупреждения врачей о возможности изменения результатов анализа.
Моча является вторым (после крови) наиболее часто исследуемым биоматериалом для лабораторных исследований. Обычно исследуется моча, выделяемая естественным путем, — пациент собирает ее либо сам, либо с помощью медицинских работников или окружающих [10]. Однако не у всех пациентов неотложной помощи это возможно: при нарушении ее выведения, после оперативных вмешательств на органах урогенитального тракта, а также при тяжелом или критическом общем состоянии больного и пребывании его в ОРИТ во многих случаях производится катетеризация мочевого пузыря. В этих целях для единовременной либо постоянной эвакуации мочи в его полость по мочеиспускательному каналу вводится катетер [5]. При длительной катетеризации мочевого пузыря — от нескольких часов до одного месяца — используются катетеры Фолея [9]. В такой ситуации лабораторному исследованию подвергается моча, получаемая через катетер. Это требует соблюдения необходимых правил ее сбора и учета того, что свойства мочи могут отличаться от свойств мочи, полученной обычным путем. Поэтому в направлении на анализ следует обязательно указывать, что моча взята из катетера.
При естественном сборе мочи зачастую используется утренняя, наиболее концентрированная ее порция; именно для нее разработаны референсные значения большинства аналитов. Кроме того, в процессе естественного мочеиспускания первая порция мочи «промывает» мочеиспускательный канал, поэтому для анализа берется не она, а последующие, более «чистые» порции [13]. При получении мочи из катетера эти приемы становятся неактуальными: свойства мочи зависят не столько от времени суток, сколько от введения инфузионных растворов, лекарственных препаратов, состояния почек и других факторов, и по результатам анализа концентрация компонентов мочи, как правило, оказывается более низкой, чем обычно. Поскольку моча через катетер выходит напрямую из мочевого пузыря, минуя уретру, то она на порции не делится, и для клинических, биохимических и микробиологических исследований ее можно брать в любой момент времени.
Для взятия мочи из уже установленного катетера на современном этапе целесообразно использовать специальные мочевые вакуумные системы (аналоги вакуумных систем для взятия венозной крови), состоящие из двусторонней иглы (либо люэр/люэр-лок-адаптера), держателя, вакуумных пробирок с консервантом или без него. Их применяют двумя способами.
«Закрытый» способ. Наружную часть установленного катетера Фолея прокалывают иглой на держателе, затем в него вставляют вакуумную пробирку, и она заполняется мочой. Способ очень прост, но при его использовании существует риск прокола катетера насквозь и случайного укола иглой медицинского персонала, а после взятия мочи в катетере остается микроотверстие, которое может служить «воротами» для восходящего инфицирования мочевых путей.
Способ с использованием адаптера. Люэр-адаптер ввинчивается в держатель пробирки и затем герметично вставляется в катетер Фолея; люэр-лок-адаптер, встроенный в держатель, своим резьбовым креплением ввинчивается в катетер. Заполнение вакуумной пробирки мочой производится как обычно. Применение подобных устройств позволяет снизить риск контаминации образца и случайного укола иглой, а также сохранить целостность катетера, что увеличивает степень безопасности пациента за счет резьбового соединения.
Кислотно-щелочное состояние (КЩС) — еще один важнейший показатель гомеостаза организма, а его исследование — один из важнейших тестов, выполняемых для пациентов в ОРИТ. При сдвигах рН в клетках изменяется активность практически всех ферментов, что ведет к быстрым сдвигам метаболизма, снижению выработки энергии и развитию клеточного энергодефицита, и в конечном итоге к нарушению жизнедеятельности клеток, тканей, органов, систем органов и организма в целом. Оценивая динамику показателей КЩС, можно судить о тяжести патологии, динамике состояния пациента и адекватности терапевтических мероприятий. По утверждению Национального комитета клинических лабораторных стандартов — NCCLS (ныне CLSI — Институт клинических лабораторных стандартов США), результаты анализа КЩС являются более значимыми для оценки состояния и выбора тактики лечения пациента, находящегося в критическом состоянии, чем любой другой вид исследований [19].
Анализ КЩС относится к категории экспресс-исследований, поскольку его параметры быстро изменяются при любых сдвигах состояния пациента (показателей дыхания, температуры тела, физической активности, функции почек и т. д.) [3]. Диагностическое и прогностическое значение полученных ранее данных постоянно снижается, т. е. результаты анализа КЩС быстро устаревают. Поэтому важно, чтобы клиницист знал о текущем состоянии КЩС у пациента, а не оперировал данными, полученными несколько часов назад. Общее время выдачи результатов анализа КЩС по ряду наиболее критичных данных не должно превышать 15—30 мин.
Хотя параметры КЩС можно определять в крови любого типа — артериальной, капиллярной и венозной, для анализа принято брать артериальную кровь из-за большей стабильности ее газового состава и метаболических параметров. Так называемая капиллярная кровь, забираемая у взрослых из пальца или у маленьких детей из боковой поверхности пятки, на самом деле артериолярная — по составу близка к артериальной, но только при условии хорошего кровотока в конечности. В венозной крови содержатся продукты тканевого метаболизма; ее газовый состав менее постоянен, в значительной степени зависит от периферического кровотока и не обеспечивает «репрезентативности» в отношении целого организма [4, 14, 16, 19].
Ключевое значение для обеспечения надежности данных имеет преаналитический этап лабораторных исследований, который при анализе электролитов и КЩС имеет ряд важных особенностей: необходимо, чтобы состояние пациента было стабильным как минимум 20 мин (особенно после окончания или прерывания лечебных и диагностических процедур), а параметры дыхания оставались неизменными в течение хотя бы 5 мин до взятия крови, иначе показатели КЩС могут быть нестабильными и искаженными. Причинение боли во время взятия крови может вызвать гипервентиляцию и, соответственно, сдвиги результатов анализа, поэтому перед взятием артериальной крови желательно обезболить место пункции, например, лидокаином или специальным пластырем. Кроме того, перед взятием крови из лучевой артерии нужно убедиться в наличии кровотока по параллельно идущей локтевой артерии (у некоторой части пациентов он недостаточен). Это даст уверенность в сохранении кровоснабжения кисти руки даже после временной закупорки (тромбоза) лучевой артерии в месте пункции. Методика выполнения пробы Аллена включает одновременное прижатие обеих артерий на 10—20 с и наблюдение за порозовением кисти после освобождения локтевой артерии [8, 16, 19, 20]. При выполнении артериальной пункции очень важно также следить за тем, чтобы игла попала именно в артерию, но не в находящуюся по соседству вену. Примесь венозной крови в шприце может исказить уровень СО 2 (завышение) и особенно О 2 (занижение) [4, 16, 18—20]. В случае ошибочной пункции вены, непопадания в артерию, сквозного прокола сосуда и остановки тока крови не следует «искать» артерию движениями иглы, так как это причиняет сильную боль пациенту; лучше наложить давящую повязку и повторить взятие крови в другом месте.
В соответствии с рекомендациями CLSI для взятия крови на анализ КЩС в качестве антикоагулянта применяется сбалансированный по кальцию гепаринат лития в концентрации 50 IU/ml [19]. Использование ЭДТА или цитрата натрия для этих целей не рекомендуется, так как может значительно изменить pH пробы. Для взятия крови могут использоваться как обычные шприцы, которые предварительно ополаскивают раствором гепарина, либо специальные шприцы с напыленным на внутренние стенки сухим гепаринатом лития или натрия. В первом случае могут наблюдаться такие побочные эффекты, как непрогнозируемое разбавление пробы (влияет на уровень гемоглобина и электролиты), непредсказуемая концентрация гепарина в образце, возрастание концентрации ионов натрия, изменение уровня ионов кальция. Поэтому использование шприцов, гепаринизированных в заводских условиях, позволяет избежать разбавление образца, повысить качество и стабильность пробы. Кроме того, это позволяет минимизировать количество ручных манипуляций и сократить время подготовки к взятию пробы. Использование шприцов с гепаринатом лития препятствует ложному возрастанию уровня натрия в образце, а с гепарином, сбалансированным по кальцию, позволяет избежать ошибок при определении ионизированного кальция.
При взятии артериальной крови на анализ КЩС путем пунктирования артерии для избежания случайного укола медицинского работника иглой при ее отсоединении от шприца (перед постановкой пробы в анализатор) рекомендуется использовать безопасные иглы с защитными насадками, «нащелкивающимися» на иглу сразу после ее извлечения из кровеносного сосуда. Далее игла снимается со шприца, а его канюля (люэр- или люэр-лок) после удаления пузырьков воздуха герметично закрывается крышкой или резиновым колпачком. Если игла остается на шприце, для герметизации на нее может надеваться специальный эластичный кубик. Перед вводом пробы в аппарат колпачки и иглы со шприца снимаются. Шприцы для взятия артериальной крови имеют объем 1 или 3 мл и должны быть заполнены до отметки 0,6 и 1,6 мл соответственно для достижения оптимальной концентрации антикоагулянта в образце. Заполнение шприца может производиться как способом самозаполнения (поршень шприца заранее устанавливается на нужный объем, и после введения иглы в артерию заполнение шприца происходит самостоятельно — под давлением крови, а остаточный воздух при этом удаляется через специальную мембрану в поршне), так и аспирационным способом (после пунктирования либо катетеризации сосуда поршень шприца медленно оттягивается до нужной метки, и шприц при этом заполняется кровью). Важно помнить, что при взятии крови из сосудистого катетера необходимо предварительно удалить остатки вводившихся через него растворов. Для этого из катетера выпускают и отбрасывают кровь в количестве не менее 3—6 его объемов, что обычно составляет 3—5 мл.
Сразу после взятия крови, во избежание образования сгустков, образец необходимо перемешать путем 5-кратного переворачивания и перекатывания шприца между ладонями в течение 5 с. Эту же процедуру желательно провести и непосредственно перед анализом — для перемешивания содержимого шприца и предупреждения ошибок, вызванных оседанием клеток. Качественное перемешивание крови с гепарином в капилляре возможно только с помощью магнитного стерженька-мешалки, помещаемого пинцетом в капилляр перед закрытием его второго конца колпачком, и постоянного магнита, которым затем несколько раз проводят вдоль капилляра (в разные стороны).
Взятая кровь также не должна соприкасаться с воздухом во избежание изменений газового состава и искажения результатов исследования. Оставленный в шприце пузырек воздуха, в зависимости от размеров и времени инкубации до анализа, способен исказить результаты определения О 2 и СО 2 на 10—25%. Поэтому немедленно после взятия крови в шприц необходимо выдавить из него все пузырьки (при необходимости — с несколькими каплями крови) и герметично закрыть канюлю резиновым колпачком или специальной крышкой. При взятии капиллярной крови избежать контакта с воздухом практически невозможно, но требуется свести его к минимуму.
Гемолиз в образце также может сильно исказить результаты анализа ионного состава и некоторые параметры КЩС (калий, кальций, парциальное давление кислорода и углекислого газа). К сожалению, обнаружить небольшой гемолиз в цельной крови почти невозможно. Основной причиной его появления являются дефекты процедуры взятия крови — прокалывание сосуда насквозь и взятие крови из гематомы, повреждение окружающих тканей, неполное испарение дезинфектанта (спирта) с поверхности кожи и т. д. В образцах капиллярной крови гемолиз бывает значительно чаще, поскольку вытекающая после прокола пальца кровь неизбежно соприкасается с поврежденными тканями и с кожей, а ее выдавливание усиливает травму клеток. Кроме того, к гемолизу ведет длительное охлаждение образца крови. Снизить влияние указанных факторов и предотвратить гемолиз помогает использование специальных шприцов для артериальной крови, тщательное выполнение правил ее взятия и минимизация времени хранения образца перед анализом (по возможности — без охлаждения).
Заключение
Отсутствие в России официальных стандартов взятия венозной крови для клинико-лабораторных тестов, а также артериальной крови для исследования КЩС вызывает ряд сложностей и порождает источник для огромного количества преаналитических ошибок. Микробная контаминация образцов мочи и проблемы при ее взятии из катетеров также является одной из главных проблем лабораторной диагностики: инфицирование мочевых путей и некорректное выявление микробного агента ведет к неадекватному назначению антимикробной терапии, нанесению вреда иммунной системе пациента и увеличению сроков лечения, а также к дополнительным финансовым издержкам, поскольку бактериологические исследования по сравнению с другими лабораторными тестами достаточно дороги.
Именно поэтому стандартизация этих процессов, особенно с учетом специфики отделений неотложной помощи, крайне необходима для уменьшения количества венепункций у пациента, обеспечения достоверности результатов лабораторных исследований, снижения риска травматизации сосуда и развития инфекционных осложнений, а также предупреждения преаналитических ошибок и снижения их влияния на качество лабораторного исследования.
Описанные выше процедуры и манипуляции по взятию венозной крови из катетеров, мочи из катетеров Фолея и артериальной крови для анализа КЩС предлагаются для рассмотрения профессиональному сообществу для создания рекомендаций по взятию биологических образцов для лабораторных исследований в отделениях неотложной помощи.
Конфликт интересов отсутствует, источника финансирования нет.