Протективность вакцины что это простыми словами
Что необходимо знать о мРНК-вакцинах: 5 позиций
В результате беспрецедентной скорости в разработке новых вакцин, миру были представлены первые клинически одобренные мРНК-вакцины
В результате беспрецедентной скорости в разработке новых вакцин, миру были представлены первые клинически одобренные мРНК-вакцины для борьбы с пандемией Covid-19 – одна из них произведена Pfizer и BioNTech, другая – компанией Moderna. Испытания показали эффективность этих вакцин на уровне не менее чем 94%.
1. Технология мРНК вакцин не так молода, как кажется
Классический механизм работы вакцин (например, против полиомиелита и гриппа) заключается в презентации иммунной системе инактивированных частиц вируса. Другие вакцины (например, против гепатита B) используют отдельно взятый белок, являющийся частью инфекционного агента, чтобы вызвать схожий иммунный ответ.
мРНК-вакцины работают по другому принципу, «обманывая» иммунную систему таким образом, что РНК (в основном матричная мРНК) кодирует белок, который продуцируется в клетке путем трансляции и представляется иммунной системе; он действует как антиген. Иммунная система учится избирательно бороться с клетками, экспрессирующими такие антигены, такими как клетки-хозяева, инфицированные вирусами, или опухолевые клетки.
Хотя вакцины от Pfizer/BioNTech и Moderna – первые препараты, одобренные в клинической практике, сама технология мРНК-вакцин существует относительно давно. Первые испытания в онкологии с использованием схожих технологий берут свое начало еще в 2011 году.
2. мРНК-вакцины не изменяют ДНК
Существуют абсолютно необоснованные опасения, что мРНК-вакцины способны изменять ДНК. На самом же деле мРНК не входит в ядро клетки, а после своего введения биодеградирует в течение нескольких дней. Именно поэтому для формирования полноценного иммунного ответа необходимо 2 инъекции препарата.
3. мРНК-вакцины имеют высокую специфичность
Вирус SARS-CoV-2 имеет достаточно сложную структуру и его различные части стимулируют иммунную систему на образование нейтрализующих антител, которые не всегда способны эффективно элиминировать инфекцию. мРНК-вакцины стимулируют иммунный ответ к спайк-белку вируса, являющегося только частью вирусной мембраны.
4. Разработчики и эксперты не «срезали углы» во время клинических испытаний
Испытания вакцин начались с доклинической фазы, проводимой на животных, а затем постепенно переходили на 1-ую, 2-ую и 3-ю фазы. Например, 3-я фаза вакцины от Pfizer/BioNTech включает более 40 000 человек, исследования эффективности и безопасности будут продлжаться следующие 2 года.
Основные проблемы, связанные с использованием вакцины, обычно возникают в первые 2 месяца. Тем не менее, не исключены редкие побочные эффекты на больших выборках в миллионы людей, поэтому за вакцинированными необходимо пристальное наблюдение, особенно с учетом инновационной природы технологии.
5. Вакцина запускает воспалительные реакции
Частично вакцина работает путем индуцирования локальных иммунных реакций, поэтому воспалительные признаки в месте инъекции и небольшой дискомфорт в первые дни – вполне нормальное явление.
Протективность вакцины что это простыми словами
«ЭпиВакКорона» – вакцина на основе пептидных иммуногенов против коронавирусной инфекции COVID-19. В этой работе мы продемонстрировали, что иммуногенность вакцины «ЭпиВакКорона» составляет порядка 70%. Также мы показали, что иммунизация этой вакциной не приводит к формированию нейтрализующих антител у здоровых добровольцев. Кроме того, с помощью компьютерного моделирования нами было установлено, что один пептид вакцины, соответствующий участку в рецептор-связывающем домене S-белка вируса SARS-CoV-2, имеет в растворе конформацию, значительно отличающуюся от конформации соответствующего участка в полноразмерном белке. Наконец, с помощью алгоритмов предсказания Т-клеточных эпитопов мы показали, что эпитопы вакцинного белка-носителя и линкерного участка в этом белке обладают наибольшей иммуногенностью среди всех компонентов вакцины.
Криницкий А. А. 2021. Исследование иммуногенности и потенциальной протективности вакцины «ЭпиВакКорона». COVID19-PREPRINTS.MICROBE.RU. https://doi.org/10.21055/preprints-3111948
1. Alexander J. et al. Development of experimental carbohydrate-conjugate vaccines composed of Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and the universal helper T-lymphocyte epitope (PADRE®) //Vaccine. – 2004. – Т. 22. – №. 19. – С. 2362-2367.
2. Bao Y. et al. Dynamic anti-spike protein antibody profiles in COVID-19 patients //International Journal of Infectious Diseases. – 2021. – Т. 103. – С. 540-548.
3. Bittle J. L. et al. Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence //Nature. – 1982. – Т. 298. – №. 5869. – С. 30-33.
4. Bloomfield G., Kay R. R. Uses and abuses of macropinocytosis //Journal of cell science. – 2016. – Т. 129. – №. 14. – С. 2697-2705.
5. Calis J. J. A. et al. Properties of MHC class I presented peptides that enhance immunogenicity //PLoS Comput Biol. – 2013. – Т. 9. – №. 10. – С. e1003266.
6. Chepurnov A. A. et al. Antigenic properties of SARS-CoV-2/human/RUs/nsk-FRCFtM-1/2020 coronavirus isolate from a patient in Novosibirsk //Jurnal Infektologii. – 2020. – Т. 12. – №. 3.
7. DeLano W. L. et al. Pymol: An open-source molecular graphics tool //CCP4 Newsletter on protein crystallography. – 2002. – Т. 40. – №. 1. – С. 82-92.
8. DiMarchi R. et al. Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide //Science. – 1986. – Т. 232. – №. 4750. – С. 639-641.
9. Farrera-Soler L. et al. Identification of immunodominant linear epitopes from SARS-CoV-2 patient plasma //PloS one. – 2020. – Т. 15. – №. 9. – С. e0238089.
10. Francis J. N. et al. A novel peptide-based pan-influenza A vaccine: a double blind, randomised clinical trial of immunogenicity and safety //Vaccine. – 2015. – Т. 33. – №. 2. – С. 396-402.
11. Goding J. W. Monoclonal antibodies: principles and practice. – Elsevier, 1996.
12. Gonzalez-Galarza F. F. et al. Allele frequency net database (AFND) 2020 update: gold-standard data classification, open access genotype data and new query tools //Nucleic acids research. – 2020. – Т. 48. – №. D1. – С. D783-D788.
13. Ichihashi T. et al. Cross-protective peptide vaccine against influenza A viruses developed in HLA-A* 2402 human immunity model //PloS one. – 2011. – Т. 6. – №. 9. – С. e24626.
14. Jensen K. K. et al. Improved methods for predicting peptide binding affinity to MHC class II molecules //Immunology. – 2018. – Т. 154. – №. 3. – С. 394-406.
15. Kerr M. C., Teasdale R. D. Defining macropinocytosis //Traffic. – 2009. – Т. 10. – №. 4. – С. 364-371.
16. Lamiable A. et al. PEP-FOLD3: faster de novo structure prediction for linear peptides in solution and in complex //Nucleic acids research. – 2016. – Т. 44. – №. W1. – С. W449-W454.
17. Li Y. et al. Linear epitopes of SARS-CoV-2 spike protein elicit neutralizing antibodies in COVID-19 patients //Cellular & molecular immunology. – 2020. – Т. 17. – №. 10. – С. 1095-1097.
18. Maksyutov R. A. et al. (November 18, 2020 – September, 2021) Study of the Tolerability, Safety, Immunogenicity and Preventive Efficacy of the EpiVacCorona Vaccine for the Prevention of COVID-19 // https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04780035 – Identifier: NCT04780035. – 2020.
19. Murphy K., Weaver C. Janeway’s immunobiology. – Garland science, 2016.
20. Ni L. et al. Detection of SARS-CoV-2-specific humoral and cellular immunity in COVID-19 convalescent individuals //Immunity. – 2020. – Т. 52. – №. 6. – С. 971-977. e3.
21. Norbury C. C. et al. Class I MHC presentation of exogenous soluble antigen via macropinocytosis in bone marrow macrophages //Immunity. – 1995. – Т. 3. – №. 6. – С. 783-791.
22. Pleguezuelos O. et al. Synthetic Influenza vaccine (FLU-v) stimulates cell mediated immunity in a double-blind, randomised, placebo-controlled Phase I trial //Vaccine. – 2012. – Т. 30. – №. 31. – С. 4655-4660.
23. Poh C. M. et al. Two linear epitopes on the SARS-CoV-2 spike protein that elicit neutralising antibodies in COVID-19 patients //Nature communications. – 2020. – Т. 11. – №. 1. – С. 1-7.
24. Reynisson B. et al. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data //Nucleic acids research. – 2020. – Т. 48. – №. W1. – С. W449-W454.
25. Ryzhikov A. B. et al. A single blind, placebo-controlled randomized study of the safety, reactogenicity and immunogenicity of the “EpiVacCorona” Vaccine for the prevention of COVID-19, in volunteers aged 18–60 years (phase I–II) //Russian Journal of Infection and Immunity. – 2021. – Т. 11. – №. 2. – С. 283-296.
26. Ryzhikov A. B. et al. Immunogenicity and protectivity of the peptide vaccine against SARS-CoV-2 //Annals of the Russian academy of medical sciences. – 2021. – Т. 76. – №. 1. – С. 5-19.
27. Skwarczynski M., Toth I. Peptide-based synthetic vaccines //Chemical science. – 2016. – Т. 7. – №. 2. – С. 842-854.
28. Soema P. C. et al. Development of cross-protective influenza A vaccines based on cellular responses //Frontiers in immunology. – 2015. – Т. 6. – С. 237.
29. Soema P. C. et al. Influenza T-cell epitope-loaded virosomes adjuvanted with CpG as a potential influenza vaccine //Pharmaceutical research. – 2015. – Т. 32. – №. 4. – С. 1505-1515.
30. Taboga O. et al. A large-scale evaluation of peptide vaccines against foot-and-mouth disease: lack of solid protection in cattle and isolation of escape mutants //Journal of virology. – 1997. – Т. 71. – №. 4. – С. 2606.
31. Walls A. C. et al. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein //Cell. – 2020. – Т. 181. – №. 2. – С. 281-292. e6.
32. Wang C. Y. et al. Effective synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine //Vaccine. – 2002. – Т. 20. – №. 19-20. – С. 2603-2610.
33. Yewdell J. W., Reits E., Neefjes J. Making sense of mass destruction: quantitating MHC class I antigen presentation //Nature Reviews Immunology. – 2003. – Т. 3. – №. 12. – С. 952-961.
34. Yi Z. et al. Functional mapping of B-cell linear epitopes of SARS-CoV-2 in COVID-19 convalescent population //Emerging microbes & infections. – 2020. – Т. 9. – №. 1. – С. 1988-1996.
35. Zeng W. et al. Characterization of SARS-CoV-2-specific antibodies in COVID-19 patients reveals highly potent neutralizing IgA //Signal transduction and targeted therapy. – 2021. – Т. 6. – №. 1. – С. 1-3.
36. Zheng Z. et al. Monoclonal antibodies for the S2 subunit of spike of SARS-CoV-1 cross-react with the newly-emerged SARS-CoV-2 //Eurosurveillance. – 2020. – Т. 25. – №. 28. – С. 2000291.
37. Zhou D. et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient //Nature structural & molecular biology. – 2020. – Т. 27. – №. 10. – С. 950-958.
38. Лагуткин Д. А., Криницкий А. А. «ЭпиВакКорона» глазами участников испытаний и ученых-биологов / Троицкий Вариант – Наука. – 2021. – №6(325). – С. 10-11, 13.
39. Плоскирева А. А. и др. Первый опыт вакцинопрофилактики коронавирусной инфекции COVID-19 пептидной вакциной «ЭпиВакКорона» //COVID19-PREPRINTS.MICROBE.RU. https://doi.org/10.21055/preprints-3111945. – 2021.
40. Протокол встречи сотрудников Роспотребнадзора, ГНЦ «Вектор» и группы добровольцев / https://epivakorona.com/protokol.vstrechi02022021.htm // epivakorona.com. 2 февраля 2021 года.
41. Роспотребнадзор и ГНЦ «Вектор» ТОП-20 вопросов о вакцине ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» / http://rospotrebnadzor.ru/about/info/news/news_details.php?ELEMENT_ID=15649 // Роспотребнадзор. 27 января 2021 года.
42. Рыжиков А. Б. и др. Вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 // Патент России №2743595. – 2021. – Бюл. №5
43. Стопкоронавирус.рф – Официальный интернет-ресурс для информирования населения по вопросам коронавируса. – 2021.
Протективность вакцины что это простыми словами
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России
ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России
ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; ООО «НТФАРМА»
Исследование иммуногенности и протективных свойств рекомбинантной вакцины против гриппа
Журнал: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020;38(3): 136-144
Седова Е.С., Степанова Л.А., Лысенко А.А., Щербинин Д.Н., Верховская Л.В., Цыбалова Л.М., Шмаров М.М. Исследование иммуногенности и протективных свойств рекомбинантной вакцины против гриппа. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020;38(3):136-144.
Sedova ES, Stepanova LA, Lysenko AA, Shcherbinin DN, Verkhovskaya LV, Tsybalova LM, Shmarov MM. Study of the immunogenicity and protective properties of recombinant influenza vaccine. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2020;38(3):136-144.
https://doi.org/10.17116/molgen202038031136
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Доклиническое изучение иммуногенности и защитных свойств противогриппозной тривалентной вакцины АдеВак-Флю на лабораторных мышах.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Вакцина АдеВак-Флю представляет собой смесь рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, экспрессирющих гены гемагглютининов вакцинных штаммов вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008, а также молекулярного адъюванта Иммуномакс. В качестве препарата сравнения была использована живая гриппозная вакцина Ультравак (ФГУП НПО «Микроген»). Для изучения защитных свойств вакцины мыши линии Balb/c были иммунизированы однократно интраназально и через 28 дней после иммунизации заражены летальными дозами вирусов гриппа A H1N1, H3N2 и B. Уровень вирусовыделения из легких мышей был оценен на 3-и и 6-е сутки после заражения с помощью титрования гомогенатов легких на культуре клеток MDCK. Уровень специфических антител к вирусам гриппа определяли методами непрямого ИФА, РТГА и РВН.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Было показано, что гриппозная тривалентная вакцина АдеВак-Флю ТМ является более иммуногенной, чем препарат сравнения. Уровни защиты от гомологичных штаммов вирусов гриппа либо чуть меньше, либо сравнимы с уровнями защиты препарата сравнения. При этом показано, что АдеВак-Флю так же, как и живая гриппозная вакцина, эффективно защищает мышей от гетерологичного штамма вируса гриппа, хотя у мышей и наблюдалось вирусовыделение из легких и незначительное снижение массы тела (менее чем на 10%).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Показано, что вакцина АдеВак-Флю на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го серотипа, экспрессирующих гены гемагглютинина вирусов гриппа A/California/07/2009 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2), B/Brisbane/60/2008, обладает иммуногенностью и защитными свойствами по отношению как к гомологичным, так и гетерологичным (в пределах субтипа) штаммам вируса гриппа.
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России
ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России
ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; ООО «НТФАРМА»
Даты принятия в печать:
Грипп — высококонтагиозное заболевание, возбудителями которого являются РНК-содержащие вирусы, относящиеся к семейству Orthomyxoviridae. Ежегодные эпидемии вызывают вирусы гриппа, относящиеся к группам А и В, причем среди людей в настоящее время циркулируют вирусы гриппа А субтипов H1N1 и H3N2 [1]. Главным методом профилактики гриппа является вакцинация. Показано, что основным антигеном вируса гриппа, вызывающим формирование нейтрализующих антител, является гемагглютинин. Профилактический эффект современных вакцин основан главным образом на выработке протективных антител именно к этому поверхностному антигену [2]. Однако современные противогриппозные вакцины являются штамм-специфичными. Благодаря антигенному дрейфу состав циркулирующих среди населения вирусов гриппа постоянно меняется, что обусловливает необходимость ежегодного обновления штаммового состава противогриппозных вакцин [3].
Одной из возможных стратегий, позволяющих расширить спектр действия противогриппозных вакцин, является так называемая генетическая вакцинация. Генетические вакцины обеспечивают попадание генетического материала инфекционного агента в клетки хозяина и экспрессию в них генов белков патогена. В результате белки патогена распознаются иммунной системой, что приводит к индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. При этом структура целевых антигенов максимально близка к их нативной структуре и позволяет добиться более широкого иммунного ответа [4]. Одним из наиболее популярных направлений в создании генетических вакцин являются вакцины на основе аденовирусов человека пятого серотипа (Ад5) [5]. Показано, что генетические вакцины на основе аденовирусов, несущие ген гемагглютинина вируса гриппа А, способны индуцировать перекрестный иммунитет как в пределах одного субтипа вируса гриппа А [6], так и между разными субтипами [7]. Ранее нами было показано, что иммунизация лабораторных мышей рекомбинантным аденовирусом (рАд5), несущим ген гемагглютинина вируса гриппа H5N2, обеспечивает индукцию протективного иммунного ответа как против вируса гриппа субтипа H5N1, так и против вируса гриппа субтипа H1N1, относящегося к той же филогенетической группе [8], но не обеспечивает защиту мышей против вируса гриппа субтипа H3N2, относящегося к другой группе [9]. Таким образом, создание кандидатных вакцин на основе рАд5, экспрессирующих гемагглютинины вирусов гриппа A и B, может позволить добиться более широкого иммунного ответа и уйти от необходимости ежегодной ревакцинации населения. Кроме того, такие вакцины позволяют отказаться от работы непосредственно с патогеном при производстве, а также включить в программу по вакцинации людей, страдающих аллергией на белки куриных яиц и не имеющих возможности вакцинироваться препаратами, в состав которых входят вирусы гриппа (или их компоненты), накопленные в куриных эмбрионах.
Цель исследования — доклиническое изучение иммуногенности и протективных свойств противогриппозной тривалентной вакцины АдеВак-Флю на лабораторных животных. Вакцина АдеВак-Флю представляет собой смесь рАд5, экспрессирующих гены гемагглютининов вакцинных штаммов вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008, а также молекулярный адъювант Иммуномакс, позволяющий существенно увеличить уровень экспрессии трансгена аденовирусным вектором [10—12].
Материал и методы
Генноинженерная кандидатная гриппозная вакцина АдеВак-Флю. Вакцина представляет собой смесь рАд5, экспрессирующих гены гемагглютинина вакцинных штаммов вирусов гриппа: A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008 с активностью 2·10 7 БОЕ/мл каждого штамма на 1 прививочную дозу (в 0,5 мл) с добавлением в качестве молекулярного адъюванта Иммуномакса в количестве 100 ЕД и стабилизирующего буфера. РАд5 были получены как описано ранее [9]. Вакцина произведена ООО «Иммафарма», Россия по заказу ООО «НТФарма», Россия.
Препарат сравнения. В качестве препарата сравнения была выбрана коммерческая живая гриппозная вакцина (ЖГВ) Ультравак производства ФГУП НПО «Микроген». ЖГВ является лиофилизатом для приготовления раствора для интраназального введения, одна ампула (0,5 мл) содержит 1 дозу вакцины. В одной прививочной дозе содержатся реассортантные вирусы гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2) — 10 6, 9 ЭИД50 и B/Brisbane/60/2008 —10 6, 4 ЭИД50.
Животные. В работе использовали мышей линии Balb/c (самки), массой 16—18 г, полученных из питомника «Столбовая» ГУ научный центр биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в виварии ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России в соответствии с действующими правилами.
Иммунизация. Были сформированы три группы животных по 40 особей. Мышам 1-й группы вводили вакцину АдеВак-Флю интраназально дискретно с интервалами 15 мин в общем объеме 0,5 мл (одна доза). Мышей 2-й опытной группы иммунизировали ЖГВ интраназально одной дозой человека, разбитой на 2 введения с интервалом 2 нед. Контрольная группа мышей получила интраназально PBS (фосфатно-солевой буфер, pH 7,2) в объеме 100 мкл.
На 28-е сутки после иммунизации у части мышей в каждой группе отбирали кровь, бронхоальвеолярные лаважи и назальные смывы. Оставшихся мышей заражали вирусами гриппа A и B.
Получение сывороток. Образцы крови получали от 5 мышей каждой группы на 28-й день после иммунизации. Для получения сыворотки кровь инкубировали в течение 30 мин при 37 °C. После образования сгустков крови образцы центрифугировали в течение 15 мин при 400 g, аликвотировали и замораживали при температуре –20 °C.
Получение назальных смывов и бронхоальвеолярных лаважей (БАЛ). Назальные смывы и БАЛ получали от 5 мышей каждой группы на 28-й день после иммунизации после умерщвления животных в атмосфере углекислого газа. Труп животного фиксировали на операционном столике брюшком кверху. Производили разрез кожи по средней линии от нижней челюсти. В верхнюю часть трахеи при помощи зонда вводили 1 мл PBS (pH 7,2) и собирали жидкость через носовые ходы. Промывание проводили 2—3 раза. В нижнюю часть трахеи в направлении легких вводили катетер на глубину 3—5 мм. Дважды промывали бронхи и легкие 1 мл PBS (pH 7,2). Смывы и БАЛ центрифугировали 15 мин при 400 g, аликвотировали и замораживали при температуре –20 °C.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Для оценки иммуногенности вакцины АдеВак-Флю в РТГА использовали вирусы гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008. РТГА проводили согласно М.У. 3.3.2.175803 [13].
Реакция вируснейтрализации (РВН). Для проведения РВН использовали вирусы гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008. Реакцию проводили на клеточной культуре MDCK. Реакцию нейтрализации ставили в соответствии с М.У. [14].
Иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА проводили общепринятым методом [15, 16], в качестве антигенов использовали очищенные гемагглютинины вирусов гриппа A/California/07/2009(H1N1), B/Brisbane/60/2008, A/Perth/16/2009(H3N2). К сорбированным на планшете антигенам добавляли исследуемые сыворотки, БАЛ или назальные смывы. После отмывки в лунки планшета добавляли антитела к Ig мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин (ТМБ). Учет реакции проводили при длине волны 450 нм. За титр принимали наибольшее разведение сыворотки, которое дает оптическую плотность, по крайней мере, в 2 раза больше, чем образец от неиммунизированных мышей в том же разведении.
Вирусы и заражение мышей. Через 28 дней после иммунизации мыши были заражены следующими вирусами: A/California/07/2009(H1N1) — 15 мышей, B/Brisbane/60/2008 — 5 и A/Aichi/2/68(H3N2) — 15. Вирусы вводили интраназально под легким эфирным наркозом в объеме 50 мкл/мышь в дозе 10ЛД50 для вирусов A/California/07/2009(H1N1) и A/Aichi/2/68(H3N2) и 3,5 lgМИД (мышиная инфекционная доза) для B/Brisbane/60/2008. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней.
Вирусовыделение из легких мышей. Легкие 5 мышей из каждой группы, извлеченные на 4-е сутки после заражения, гомогенизировали в 10-кратном объеме стерильного PBS и готовили из гомогенатов серию 10-кратных разведений на том же буфере. При определении титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK, выращенных на 96 луночных планшетах на среде МЕМ. Клетки заражали серийными 10-кратными разведениями легочного гомогената от 10 до 10 –7 и инкубировали в термостате в течение 72 ч. По окончании срока инкубации культуральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% куриных эритроцитов в физиологическом растворе. Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. Инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lgТЦД50.
Статистическая обработка данных
Статистическую значимость различий титров специфических антител в сыворотках, назальных смывах и БАЛ оценивали с использованием U-критерия Манна—Уитни. Динамика изменения массы тела оценивалась с использованием программы GraphPadPrismv. Сравнение показателей выживаемости в различных группах мышей — с использованием тестов Mantel—Cox (log-rank) и Gehan—Breslow—Wilcoxon.
Результаты и обсуждение
Иммуногенность кандидатной гриппозной вакцины АдеВак-Флю. Для оценки иммуногенности вакцины в сыворотках крови иммунизированных животных на 28-й день после иммунизации определяли титры специфических антител изотипа IgG в ИФА, титры гемагглютинирующих антител в РТГА и титры нейтрализующих антител в РВН к штаммам вирусов гриппа A/California/07/09(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2) и B/Brisbane/60/2008. В назальных смывах и БАЛ определяли содержание специфических секреторных IgA к тем же штаммам.