средняя продолжительность жизни атф

Биология

Лучшие условия по продуктам от Тинькофф по этой ссылке

Дарим 500 ₽ на баланс сим-карты и 1000 ₽ при сохранении номера

. 500 руб. на счет при заказе сим-карты по этой ссылке

Лучшие условия по продуктам
ТИНЬКОФФ по данной ссылке

План урока:

Метаболизм

Всякая живая клеточная структура постоянно осуществляет различные реакции, которые обеспечивают все основные процессы, необходимые для нормального существования. Так обеспечивается постоянство условий внутренней среды биологической системы или гомеостаз. При нарушении этих условий происходит сбой в работе всей системы, что способно привести к гибели не только отдельной клетки, но и всего организма. Соответственно, все процессы ориентированы на поддержание именно гомеостаза.

С целью реализации трудоемких биохимических реакций требуются различные соединения, а также энергия, получаемые организмом при метаболизме.

Получается, что ассимиляция и диссимиляция – это взаимозависимые процессы, протекающие синхронно.

Любой организм, вследствие питания, получает извне различные вещества и микроэлементы, используемые в процессе ассимиляции.

Ассимиляция – это процесс, состоящий в формировании соединений, а также составных частей клетки. Данные реакции иначе именуются анаболизм или пластический обмен. Примером ассимиляции может быть образование белковых молекул.

Любые реакции синтеза проходят с расходом энергии. Источником ее выступают ранее образованные соединения, находящиеся в клетке. Они подвергаются распаду вследствие протекания совокупности процессов диссимиляции.

Частично освобождающаяся энергия применяется при синтезе различных соединений, часть рассеивается с теплом или запасается.

Соответственно, диссимиляция – это процесс,заключающийся в разложении веществ с освобождением энергии.

Процесс диссимиляции в организме именуется еще катаболизм или энергетический обмен.

Ассимиляция и диссимиляция не могут существовать по отдельности. Нарушение баланса этих процессов приведет к развитию заболеваний или гибели организма. К примеру, это может выразиться в истощении или ожирении.

Метаболизм в клеточных структурах протекает при средней температуре, нормальном давлении и нейтральной среде. Из курса химии нам известно, что только повышение данных показателей приведет к ускорению реакции. При таких же условиях реакции должны протекать очень медленно. Однако, в биологических системах есть помощники метаболизма – ферменты.

Роль ферментов в метаболизме огромна. Данные структуры ускоряют реакцию без изменения ее общего результата. Причем абсолютно все процессы в организме протекают при участии ферментов. К примеру, под их действием происходит разложение пищи на составные компоненты.

Исходя из значения ферментов в метаболизме можно сказать, что нарушение их образования и активности приведет к различным заболеваниям.

Энергетический обмен

Диссимиляция или энергетический обмен проходит в несколько этапов. Познакомимся с ними на схеме.

Примером подобного процесса считается гликолиз – многоступенчатое расщепление глюкозы. Мономеры углеводов подвергаются распаду в отсутствии кислорода с освобождением энергии, определенное количество которой расходуется для формирования АТФ.

При протекании ряда последовательных этапов гликолиза совершается разложение молекулы глюкозы на две молекулы пировиноградной кислоты. Чаще всего, пировиноградная кислота затем преобразуется в молочную кислоту. Вследствие этих реакций в ходе гликолиза из АДФ, а также фосфорной кислоты синтезируются 2 молекулы АТФ.

Следует учесть, что по такому принципу гликолиз протекает в клетках животных и человека.

В растительных клетках, в отдельных дрожжевых грибах, у бактерий бескислородный этап осуществляется как спиртовое брожение.

В реакции спиртового брожения могут вступать всевозможные соединения. Например, углеводы, органические кислоты, спирты, аминокислоты и многие другие. Широкое распространение получили реакции расщепления глюкозы при молочнокислом, а также спиртовом брожении.

У молочнокислых бактерий спиртовое брожение сопровождается ферментативным расщеплением глюкозы и продуктом является молочная кислота.

Суммарные уравнения молочнокислого и спиртового брожения рассмотрим на рисунке.

Вследствие бескислородной стадии энергетического обмена вещества распадаются не до конечных продуктов, а до соединений с запасом энергии. Поэтому они переходят в следующий этап – кислородный.

3. Третья стадия энергетического обмена получила название аэробного или кислородного.В течение данных реакций осуществляется последующее разложение органических соединений до конечных продуктов. Характерен он только аэробным организмам, использующим для метаболизма кислород.

Происходит кислородный распад в митохондриях, поэтому именуется еще клеточным дыханием. Протекает оно в несколько поочередных стадий. Основным признаком клеточного дыхания является участие кислорода в распаде соединений.

В процессе клеточного дыхания осуществляется дальнейшее окисление пировиноградной кислоты с формированием двуокиси углерода и воды.

Данный этап считается заключительным, поэтому при клеточном дыхании выделяется внушительное число энергии в виде 36 молекул АТФ.

Вследствие процесса энергетического обмена веществ при окислении одной молекулы глюкозы формируется 38 молекул АТФ. Эта энергия используется на другие химические реакции. К примеру, у человека каждая молекула АТФ расщепляется и вновь создается 2400 раз в сутки, то есть средняя продолжительность жизни АТФ менее минуты.

Питание клетки

Для протекания метаболизма в клетке необходимы различные питательные вещества, которые организм получает в результате питания.

Все живые организмы различаются по тому, какую пищу они используют. Некоторые организмы способны сами производить вещества, другие же в процессе питания клетки потребляют уже готовые.

Различают несколько разновидностей организмов по способу питания клетки:

1. Автотрофы сами производят органические вещества. Для осуществления процессов синтеза они используют простые неорганические соединения – углекислый газ и воду. Источником энергии для протекания ассимиляции в клетке у автотрофов является солнечный свет или энергия химических взаимодействий.

Организмы, использующие солнечный свет для формирования органических соединений получили название фототрофы. Этим существам характерен фотосинтез, протекающий в хлоропластах. Соответственно, фототрофами являются все зеленые растения. Помимо этого, примером фототрофов считаются цианобактерии, зеленые и пурпурные бактерии.

Организмы, которые для производства органических соединений используют энергию химических взаимодействий, называются хемотрофами.

Хемотрофами являются некоторые бактерии, к примеру, железобактерии, серобактерии, нитрифицирующие бактерии.

Вдобавок есть организмы, применяющие для питания клетки автотрофный и гетеротрофный способ. К этим организмам относится эвглена зеленая. У нее есть хлоропласты и она может сама производить вещества для питания клетки как автотрофы. Однако в темноте, ее питание осуществляется гетеротрофным способом как у животной клетки.

Фотосинтез

Одним из примеров ассимиляции является процесс фотосинтеза у растений.

Фотосинтез происходит в фотосинтезирующем пигменте хлорофилле хлоропластов листа. Данный пигмент считается чрезмерно активным соединением и реализует поглощение света, начальный запас энергии, также последующая ее трансформация в химическую энергию.

Принято выделять световую и темновую фазы фотосинтеза. Остановимся детальнее на них.

Световая фаза совершается в мембранах хлоропластов. Наступает световая фаза фотосинтеза с поглощения кванта света молекулой хлорофилла. Один из электронов хлорофилла переводится на высочайший энергетический уровень и вступает в возбужденном состоянии. Электроны с большим избытком энергии активизируют разложение воды. Данная процедура, протекающая на начальной стадии фотосинтеза, приобрела наименование фотолиз воды.

В процессе световой фазы фотосинтеза совершается превращение световой энергии в химическую энергию макроэргических связей молекулы АТФ. В данной фазе фотосинтеза осуществляется выброс кислорода, являющегося второстепенным продуктом. Он может употребляться дальше растительными клетками при дыхании или выделяться в биосферу.

2. В момент темновой фазы фотосинтеза проистекают трудоемкие ферментативные взаимодействия. Основой считается трансформация молекул углекислого газа до органических соединений. Протекает данная стадия в строме хлоропластов в присутствии продуктов световой реакции.

Основным признаком темновой фазы фотосинтеза считается отсутствие солнечного света.

Начинается данная стадия с проникновения углекислого газа в листья через устьица. Затем он соединяется со своеобразным веществом – акцептором, которым выступает при фотосинтезе пятиуглеродный сахар – рибулозодифосфат. Вследствие этого формируется нестойкое соединение, разлагающиеся на 2 молекулы фосфороглицериновой кислоты. Эти молекулы подвергаются воздействию продуктов светового фотосинтеза, в частности АТФ.

Впоследствии, посредством некоторых переходных стадий, создаются углеводы, а также прочие органические соединения. Данный процесс трансформации углекислого газа в углеводы в темновой фазе фотосинтеза приобрел наименование цикла Кальвина.

В темновом фотосинтезе энергия макроэргических связей АТФ трансформируется в химическую энергию органических соединений. Данные вещества служат пищей для гетеротрофов.

Соответственно, первостепенными веществами темнового и светового фотосинтеза считаются кислород, а также углеводы.

Благодаря данному процессу возможно существование всех живых существ на Земле. Ведь он является одним источником свободного кислорода.

Хемосинтез

Помимо фотосинтеза имеется еще один процесс автотрофной ассимиляции – хемосинтез, типичный отдельным видам микроорганизмов.

Основой энергии для хемосинтеза здесь служит не свет, а окисление отдельных неорганических соединений. Открытие хемосинтеза у таких организмов как бактерии принадлежит русскому ученому С.Н. Виноградскому.

Важнейшей группой данного типа питания считаются нитрифицирующие бактерии. Они могут окислять возникающий при гниении остатков аммиак до нитрита, а также до нитрата. Вследствие этого совершается освобождение энергии, нужной нитрифицирующим бактериям для жизненных функций.

Хемотрофные нитрифицирующие бактерии массово встречаются в природной среде. Они находятся в почве, в различных водоемах. Исполняемые ими процессы считаются частью круговорота азота.

Серобактерии – это еще одни существа, способом питания которых является хемосинтез. Вследствие этого они окисляют сероводород и накапливают в своих клетках серу.

К серобактериям относятся многие автотрофные пурпурные, а также зеленые бактерии.

Серобактерии являются разрушителями горных пород, в связи с формированием серной кислоты в ходе питания. Выделяемая ими едкая жидкость активизирует порчу различных сооружений.

Многочисленные типы серобактерий в ходе питания образуют всевозможные производные серы. Это способствует очищению промышленных сточных вод.

В процессе питания железобактерии переводят железо (II) в железо (III). Освободившаяся энергия употребляется с целью восстановления углекислого газа до органических соединений.

Хемосинтетики – единственные организмы, жизнь которых не связана с освещением. Соответственно они способны существовать в различных местах, осваивая глубины океана или недра земли.

Источник

Муковисцидоз — первые надежды

Муковисцидоз — первые надежды

CFTR — хлорный канал, мутации в котором являются причиной муковисцидоза. TMD — трансмембранный домен.

Автор

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Муковисцидоз — самое распространенное из моногенетических заболеваний (обусловленных поломкой одного гена). При нем нарушено функционирование белка-переносчика ионов хлора через мембрану клетки — хлорного канала CFTR. Так как этот канал отвечает за нормальную работу эпителия в легких, кишечнике, поджелудочной железе и других органах, его дисфункция приводит к накоплению в этих органах слизи, повышению вероятности инфекций и в конце концов к преждевременной смерти. До последнего времени врачи могли лечить только симптомы муковисцидоза: разжижать слизь, расширять бронхи, снижать воспаление, а также уничтожать бактерий антибиотиками, причем все эти меры почти не продлевали жизнь. Но за последние годы был достигнут невиданный прогресс: средняя продолжительность жизни больных возросла более чем в два раза. В этой статье будет рассказано о препаратах, благодаря которым стал возможен такой успех, об истории их создания и перспективах. На данных примерах читатель также узнает, как происходит современная разработка лекарств.

Конкурс «био/мол/текст»-2018

Эта работа опубликована в номинации «Биофармацевтика» конкурса «био/мол/текст»-2018.

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.

Описание заболевания

Вначале рассмотрим подробнее, что за болезнь муковисцидоз и почему разработка лекарств против него оказалась таким непростым делом.

Большинство случаев этого страшного заболевания диагностируют в первые годы жизни, потому что муковисцидоз поражает все органы, но особенно — легкие и кишечник. Больные страдают от многочисленных нарушений работы почти всех систем организма: дыхательной, пищеварительной, опорно-двигательной, нервной, сердечно-сосудистой и других. Средняя продолжительность жизни больных составляет 30–40 лет (и сильно зависит от качества ухода), 90% пациентов умирает от легочных осложнений.

Муковисцидоз (или кистозный фиброз, как он называется по-английски) возникает у тех людей, у которых плохо работает или отсутствует белок CFTR. Его название расшифровывается как cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, то есть регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе. Сейчас разберемся, какова роль CFTR в норме и почему его недостаток приводит к таким тяжелым последствиям.

Знай врага своего

Муковисцидоз — самое распространенное заболевание, вызванное одной генетической причиной. Ежегодно в России рождается около 650 человек с муковисцидозом [2], а в мире — один на 2000–5000 новорожденных страдает этой болезнью. В России на 2016 год таких больных было зарегистрировано около 3000, а во всем мире порядка 100 000 [3].

То есть он пронизывает мембрану клетки насквозь.

АТФ — аденозинтрифосфорная кислота, основная молекула, которая запасает и передает химическую энергию в клетках.

Рисунок 1. Диаграмма предполагаемой структуры белка CFTR в закрытом (слева) и открытом (справа) положениях. Два трансмембранных домена образуют канал. Открытие канала контролируется двумя внутриклеточными доменами (NBD1 и NBD2), которые способны связывать и гидролизовать АТФ (голубой). Регуляторный домен (зеленый) содержит сайты фосфорилирования (Р). Активация канала требует наличия остатка фосфорной кислоты на регуляторном домене. NBD1 и NBD2 связывают и гидролизуют АТФ, вызывая открытие канала путем взаимодействия с трансмембранными доменами. Одна из молекул АТФ остается связанной с NBD1 в течение нескольких минут. За это время происходит несколько циклов открывания-закрывания канала, обусловленных связыванием и гидролизом второй молекулы АТФ [4], [5].

Наличие ионов вблизи поверхности клеток необходимо для поддержания нормального осмотического давления, а это важно для циркуляции жидкости в околоклеточном пространстве. Поэтому постоянный контролируемый поток ионов хлора через мембрану необходим для нормального функционирования эпителия легких, кишечника, протоков поджелудочной железы, яичников, потовых желез.

При муковисцидозе в первую очередь поражаются именно эти органы: в железах образуется густая слизь, которая забивает протоки и мешает нормальной работе органов. А вот почему в легких и кишечнике нарушается работа врожденной иммунной системы, возникает хроническое воспаление и инфекции — стало более-менее понятно совсем недавно. На нынешний момент картина примерно такая: снижение концентрации ионов хлора в околоклеточном пространстве вызывает активацию эпителиального натриевого канала ENaC, который начинает закачивать натрий в клетку. Уменьшение концентрации NaCl возле поверхности клетки вызывает снижение осмотической силы, а, следовательно, количества воды, поступающей к клетке. В случае легких это приводит к осушению воздушных путей и снижению очищающей активности ресничек и слизистой оболочки (рис. 2 во врезке).

Патогенез муковисцидоза

Поверхностный реснитчатый эпителий легких покрыт слоем геля, который называется ASL (airway surface liquid, легочный сурфактант). Он состоит из белков (преимущественно муцинов) и ДНК в солевом растворе. В норме, во время дыхания, его толщина составляет 25 мкм. У больных муковисцидозом толщина геля сокращается до 3 мкм, и реснички при этом не работают в полную силу (рис. 2). Однако в ответ на механический стресс многие клетки, в том числе эпителиальные, выделяют АТФ, ионные каналы (не только хлорный, но и натриевый и кальциевый) получают дополнительную стимуляцию, и ASL увеличивается до 7 мкм. Поэтому постукивание по грудной клетке является эффективным способом помощи от удушья при муковисцидозе [6].

Рисунок 2. Модель патогенеза муковисцидоза. В нормальных воздушных путях (слева) толщина слизистого слоя (ASL) обусловлена нормальной работой каналов CFTR и ENaC. MCC — мукоцилиарный клиренс, то есть скорость очистки воздушных путей с помощью движения слизи (в мкм/с). При муковисцидозе (справа) из-за дефектного CFTR снижение количества ионов хлора вызывает усиленную абсорбцию ионов натрия, что приводит к дегидратации поверхности, повышению вязкости слизи и компрессии ресничек. Неподвижная слизь может вызывать воспалительную реакцию сама по себе, а также является идеальной средой для размножения бактерий.

Постоянный ток слизи вдоль поверхности воздушных путей очень важен для функционирования защитной системы легких. При этом слизь должна быть достаточно жидкой, чтобы растекаться по поверхности эпителия после секреции, но и достаточно вязкой, чтобы движение ресничек эпителия вызывало ее направленный ток. У больных муковисцидозом слизь содержит слишком мало воды, поэтому она густая и неподвижная, от нее трудно избавиться даже при кашле. Собственно, русское название болезни и происходит от двух латинских слов: mucus («слизь») и viscosus («вязкий»).

Поскольку слизь — это полимерная сетка, образованная белками, она содержит поры. Характерная черта слизи при патологии — слишком мелкий размер пор. В нормальной слизи они имеют диаметр 0,2–1 мкм, а при болезни — менее 0,1 мкм. В результате нейтрофилы — клетки иммунной системы, которые в первую очередь отвечают за защиту от бактерий, — не могут проникнуть изнутри сквозь слой слизи. Бактерии на поверхности воздушных путей размножаются беспрепятственно и вызывают хронические инфекции, которые являются главной причиной смертности при муковисцидозе (80% пациентов) [7]. Более того, на уплотненной слизи, в отличие от обычной, бактерии образуют макроколонии, так называемые биопленки, которые особенно устойчивы к действию иммунной системы и антибиотиков [8].

Из сказанного понятно, что одним из средств улучшить состояние больных муковисцидозом должна быть регидратация легких, которую можно обеспечить с помощью ингаляции гипертонического раствора соли. Это паллиативная мера, не воздействующая на причину болезни, но, тем не менее, она позволяет снизить количество осложнений [6].

Не только легкие: что еще поражается при муковисцидозе

В нашей статье речь идет в основном о легких, потому что легочные проявления муковисцидоза наиболее заметны, однако в той или иной мере при болезни затрагиваются все органы, где в норме экспрессируется CFTR.

У 85–90% пациентов наблюдается экзокринная поджелудочная недостаточность, то есть дисфункция протоков поджелудочной железы, которые вырабатывают пищеварительные ферменты. Из-за этого таким больным с рождения требуется специальное питание через трубку, так как они не способны переваривать грудное молоко и обычные смеси.

У большинства больных возникают проблемы с фертильностью, так как с разной степенью тяжести поражаются протоки половых желез, эпителий половых органов.

Помимо этого, в зависимости от типа заболевания могут поражаться носоглотка, желудочно-кишечный тракт (возникает непроходимость кишечника), желчный пузырь (появление камней), сердце (увеличение) и другие органы.

До открытия молекулярных причин болезни пациентов лечили только симптоматически — разжижая слизь, применяя антибактериальные, противовоспалительные препараты и физиотерапию. У пациентов с нарушениями ЖКТ и поджелудочной железы эффективна терапия диетами и пищеварительными ферментами. Все эти меры облегчают состояние пациентов, однако настоящий скачок в продлении жизни и улучшении ее качества стал возможным только благодаря открытиям молекулярной биологии и рациональной разработке лекарств [9], [10].

Фокус на CFTR

Курсивом обозначается ген, а прямым шрифтом — соответствующий ему белок.

Мутации удобно разделить на несколько классов в соответствии с тем, какие последствия они вызывают (рис. 3) [12].

Рисунок 3. Классы мутаций CFTR при муковисцидозе. GA — аппарат Гольджи; ER — эндоплазматический ретикулум. Красный овал — ядро клетки.

Мутации I класса

Мутации I класса встречаются примерно у 10% пациентов. При них белок CFTR вообще не синтезируется или синтезируется в усеченном виде и сразу деградирует, потому что в гене произошла замена кодирующего аминокислоту кодона на стоп-кодон, или сдвиг рамки считывания, или появился сигнал неправильного сплайсинга. Самая частая мутация — замена глицина-542 на стоп-кодон.

Мутации II класса

Наиболее распространены мутации II класса, вызывающие неправильные сворачивание белка и последующий процессинг клеточными механизмами. Самая частая мутация — F508del (делеция фенилаланина в положении 508 ). 70% пациентов гомозиготны по этой мутации (то есть она присутствует в обеих копиях гена CFTR), а у 90% есть хотя бы один мутантный аллель [14]. У гомозиготных пациентов наблюдается тяжелое течение муковисцидоза, а гетерозиготы по CFTR-F508del, у которых одна из копий гена нормальна, не имеют симптомов болезни. Существует гипотеза, объясняющая стабильность такого тяжелого заболевания в человеческой популяции: у гетерозигот в меньшей степени происходит потеря воды при болезнях, сопровождающихся диареей, например, при холере и брюшном тифе. Соответственно, раньше, когда эти болезни были одной из основных причин смертности, особенно детской, шел отбор на дефектные копии гена [15].

F — обозначение фенилаланина, а del обозначает делецию, то есть отсутствие аминокислоты.

Мутация F508del приводит к тому, что белок неправильно сворачивается и еще в эндоплазматическом ретикулуме не проходит «контроль качества» со стороны клеточных систем и направляется на деградацию, не доходя до плазматической мембраны.

Подробности о мутации F508del

Рисунок 4. Расположение фенилаланина-508 (F508) в структуре CFTR

Фенилаланин-508 находится в домене NBD1 (рис. 4) в области контакта с трансмембранным доменом [16], [17]. Потеря фенилаланина в этом положении приводит к нестабильности контакта между доменами, и плохо свернувшийся белок распознается шаперонами эндоплазматического ретикулума — белками, которые обеспечивают дальнейшее присоединение убиквитиновой метки к дефектному белку. Помеченный убиквитином белок транспортируется в протеасому, где разрезается на части протеазами [18]. Кстати, эффективность транспорта нормального CFTR из эндоплазматического ретикулума к поверхности также сравнительно невелика и находится на уровне 60% [14].

Впрочем, 1% неправильно свернутого CFTR-F508del все же может достигнуть клеточной поверхности, но там он работает с очень низкой эффективностью из-за того, что мутация нарушает правильную подвижность доменов, необходимую для открывания и закрывания канала [19] (см. врезку). Кроме того, в течение 2,5 минут белок удаляется с поверхности в эндосомы, и там снова решается его судьба: он либо возвращается обратно в плазматическую мембрану клетки, либо уничтожается. Понятно, что большинство мутантных молекул будет при этом уничтожено.

Мутации III класса

Мутации III класса встречаются у 4–5% пациентов и приводят к неправильной регуляции открытия ионного канала. Из них наиболее обычная — G551D, то есть замена глицина в 551 положении домена NBD1 на аспарагиновую кислоту. Она приводит к тому, что канал остается преимущественно закрытым. Появление в этом положении остатка аспарагиновой кислоты с отрицательно заряженной боковой цепью —CH₂–COO − препятствует связыванию АТФ и сближению доменов NBD1 и NBD2 из-за отталкивания отрицательных зарядов между аспартатом и фосфатными группами АТФ, а также кислотными остатками домена NBD2 [19].

Мутации IV и других классов

Некоторые исследователи различают также мутации классов V–VI, при которых производится работающий белок, но в недостаточных количествах, или происходит быстрое удаление CFTR с поверхности клеток. У таких пациентов течение болезни также сравнительно легкое [11].

Другие причины муковисцидоза

Мы разобрали тут мутации самого белка CFTR, однако понимание молекулярных причин патогенеза муковисцидоза осложняется тем, что CFTR взаимодействует с массой других белков в клетке. Мы уже упоминали выше шапероны, отвечающие за правильное сворачивание (фолдинг) CFTR, и транспортные белки, которые переносят его в плазматическую мембрану. В последние годы с помощью полногеномного секвенирования и поиска ассоциаций (genome-wide association studies, GWAS) [20] идентифицировали еще ряд партнеров по связыванию с CFTR, которые явно играют роль в конкретных проявлениях муковисцидоза. Это и белки, участвующие в иммунном ответе, и другие ионные каналы, и муцины — всего более сотни белков [21].

Почему для муковисцидоза — самого распространенного наследственного заболевания — первые препараты, направленные на молекулярную причину болезни, появились только недавно, в 2012 году? Причин несколько: во-первых, сломать проще, чем починить, поэтому среди лекарств гораздо больше ингибиторов, блокаторов, антагонистов, чем активаторов и агонистов. В случае CFTR требуется восстановить неработающую функцию, что гораздо сложнее. Во-вторых, при других наследственных заболеваниях, обусловленных дефектом одного гена (например, гемофилии или болезни Гоше), пациентам, как правило, помогает введение дефектного белка в виде инъекций. В случае муковисцидоза проблема так просто не решается. CFTR — мембранный белок, и если его просто ввести пациенту, он не попадет в мембрану эпителиальных клеток и не будет выполнять там нужные функции. Делаются попытки разработать генную терапию муковисцидоза, например, доставить ген CFTR в клетки с помощью вирусных частиц, но они пока не увенчались успехом.

А вот малые молекулы, которые были разработаны с учетом сведений о структуре и функции CFTR, уже произвели революцию в лечении муковисцидоза, и, надеемся, это только начало. О них мы и поговорим дальше.

«Калидеко»: первая ласточка

Сразу после открытия факта, что муковисцидоз вызван мутациями в гене CFTR, у исследователей возникло желание синтезировать вещества, которые могли бы хоть отчасти скомпенсировать эффект данных мутаций. Довольно быстро стало понятно, что эти вещества будут грубо делиться по своей функции на два типа — корректоры, которые будут повышать количество дефектного белка (например, с мутацией F508del) на поверхности клетки, и потенциаторы, которые будут усиливать активность белка, уже находящегося на поверхности. Наиболее простой мишенью при этом выглядят мутации класса III: при них белок правильно свернут, находится на мембране, но преимущественно в закрытом состоянии. Поэтому с 2000-х годов начали поиск таких соединений, которые бы повышали вероятность его пребывания в открытом состоянии [22].

Первые несколько классов соединений были либо недостаточно активны, либо малоселективны (то есть связывались и с другими белками), либо обладали неподходящими фармакологическими свойствами (плохая растворимость, стабильность, проникновение в ткани). Наконец в 2009 году, после многочисленных раундов поиска оптимальной структуры, была опубликована структура вещества VX-770 (рис. 5), позже получившего название ивакафтор (торговое наименование — «Калидеко», Kalydeco) [23]. Расскажем немного подробнее обо всём пути разработки этого соединения.

Рисунок 5. Химическая структура ивакафтора («Калидеко», VX-770) (а) и генистеина (б)

История разработки началась в 2000 году. В ту пору компания Aurora Biosciences, которая занималась разработкой систем скрининга для Большой фармы, решила инициировать свою собственную разработку и получила грант от Фонда муковисцидоза (Cystic Fibrosis Foundation). В 2001 году Aurora была куплена компанией Vertex Pharmaceuticals, и та продолжила исследования.

Скрининг — в данном случае процесс выбора нужной молекулы из большого множества.

Для начала потребовалось создать систему скрининга, которая бы подходила для отбора веществ, активных в отношении мутантов CFTR. Для первичного отбора использовали клеточную культуру мышиных фибробластов, синтезирующих мутантный CFTR-F508del. Для определения влияния исследуемой молекулы на хлорный канал ее добавляли к клеточной культуре, затем добавляли флуоресцентный маркер, чувствительный к изменениям мембранного потенциала из-за потока ионов хлора и «включали» CFTR, добавляя форсколин, активирующий канал.

Так было протестировано 228 000 соединений [24], многие из которых отдаленно напоминали генистеин — известный потенциатор CFTR, который, однако, не подходит для лекарственного применения из-за низкой активности и быстрой деградации в организме.

Путь «Калидеко»

Для дальнейшего тестирования брали те соединения, которые были на 65% сильнее генистеина. Так было отобрано 1535 молекул, из которых 278 подтвердили свою активность в повторном тесте. Из них было откинуто еще 145 соединений по причине наличия примесей и потенциальных сложностей синтеза. Оставшиеся 133 молекулы подвергли дополнительному отбору на других клеточных линиях и культурах эпителиальных клеток, в том числе синтезирующих мутант CFTR-G551D. Для лучшего соединения (оно называется «лид» — от англ. lead) был синтезирован ряд аналогов и подвергнут тестированию на способность потенцировать ряд мутантов CFTR, а также на селективность и благоприятные фармакокинетические свойства у животных.

Фармакокинетика — это превращения лекарства в организме, то есть его всасывание, распределение по тканям, метаболизм и выведение.

Время, за которое концентрация вещества, введенного в организм, падает в два раза.

Цитохромы P450 — белки печени, которые отвечают за метаболизм многих лекарств, причем у разных людей по-разному. Чем меньше лекарство на них влияет, тем меньше вероятность взаимодействия с другими лекарствами, потенциальная токсичность и вариабельность действия.

Затем VX-770 тщательно изучали in vitro (на изолированных клетках) и in vivo (на животных) [22]. Определили фармакокинетические параметры молекулы у мышей, крыс, собак и обезьян, показали пероральную биодоступность у крыс и собак на уровне 40–50% (то есть что почти половина проглоченного препарата попадает в кровь).

Исследования эффективности на животных моделях для ивакафтора не проводили, хотя, как правило, это необходимо для получения разрешения на клинические исследования. Но в данном случае подходящей модели не было, потому что ивакафтор не связывается с мышиным CFTR, а трансгенных мышей с человеческим белком не было на момент выхода препарата в клинические исследования.

Разработка препарата шла невероятно быстро: уже в 2008 году были опубликованы первые клинические данные для ивакафтора, а к моменту регистрации в 2012 году были доступны данные трех клинических исследований. На 2018 год в пяти двойных слепых клинических исследованиях [25], [26] уже приняли участие 342 пациента. Основным показателем, который изучается у больных муковисцидозом, является FEV1 — объем форсированного выдоха (forced expiratory volume) за одну секунду. Причем измеряется не абсолютный объем, а процент от нормы для данного пола, возраста, расы и роста. Другие важные показатели — безопасность препарата, частота легочных обострений (выражается в необходимости приема антибиотиков и госпитализации) и качество жизни (определяется по анкете, которую заполняет пациент).

Клинический случай

Вот как выглядит эффект ивакафтора у отдельного пациента: у мужчины 33 лет с муковисцидозом оказался генотип F508del/G551D. FEV1 за последние годы упал с 85% до 67% от нормального. Пациенту приходилось принимать 2–3 курса антибиотиков в год, он страдал поджелудочной недостаточностью, похудением, регулярными запорами и прогрессирующим поражением суставов. Через несколько дней после начала приема ивакафтора начали улучшаться все симптомы, мокроты стало меньше, и она стала лучше отходить. Через месяц функция легких улучшилась на 15% [27].

Рисунок 6. Ожидаемая продолжительность жизни без муковисцидоза, с муковисцидозом при применении ивакафтора и с муковисцидозом без ивакафтора

Ивакафтор у детей и взрослых с мутацией G551D через 24 недели приема по сравнению с плацебо улучшал FEV1 на 5–10% и снижал риск обострений на 55%. У взрослых (но не у детей) он также повышал качество жизни по сравнению с плацебо. Воздействие препарата на ионный канал подтверждалось снижением концентрации хлорида в потовой жидкости [27], [28]. Затем ивакафтор показал эффективность и при наличии других мутаций класса III [11]. Немаловажно, что препарат оказался очень безопасным — частота побочных эффектов не превосходила плацебо. К сожалению, в России он так до сих пор и не зарегистрирован.

Хотя пока недостаточно данных для того, чтобы говорить о снижении смертности от муковисцидоза под воздействием ивакафтора, но проведенное моделирование показывает, что его влияние на FEV1 способно вылиться в увеличение продолжительности жизни в среднем на 15 лет (рис. 6), а также снизить потребность в трансплантации легких [29].

Механизм действия «Калидеко»: пока гипотеза!

Точный молекулярный механизм действия ивакафтора пока так и не установлен. Только в 2018 году получили данные [32], говорящие о том, что он связывается с трансмембранным доменом CFTR и каким-то образом стабилизирует открытое состояние (рис. 7).

Рисунок 7. Предполагаемый механизм действия ивакафтора (VX-770). Ивакафтор (желтый) связывается с белком CFTR и стабилизирует его в открытом состоянии, позволяя ионам хлора выходить наружу.

Несмотря на то, что ивакафтор оказался настоящим прорывом в терапии муковисцидоза, его недостаток в том, что он помогает всего 4–5% больных — у пациентов с гомозиготной мутацией F508del он оказался неэффективен [34]. Такой факт мог бы показаться странным, если учесть, что ивакафтор был отобран по активности на клетках с CFTR-F508del. Однако не нужно забывать: эти клетки предварительно выдерживались при комнатной температуре, что помогает правильно свернуться даже мутантному белку, поэтому на их поверхности было достаточно CFTR-F508del.

Комбинации

Понятно, что для охвата большинства пациентов надо создавать молекулы, эффективные у пациентов с мутацией F508del (напомним, они называются корректорами). Компания Vertex взялась за разработку таких препаратов одновременно с потенциаторами. После скрининга 164 000 молекул и нескольких раундов оптимизации было синтезировано вещество VX-809, которое в клеточных тестах в семь раз улучшало созревание CFTR-F508del и в пять — его способность переносить ионы хлора [35]. Позже оно получило название люмакафтор (lumacaftor).

Люмакафтор пробовали применять в режиме монотерапии (без сочетания с другими препаратами), но он оказался малоэффективен. Поэтому Vertex провела клинические исследования комбинации люмакафтор/ивакафтор, которая получила название «Оркамби» (Orkambi), и зарегистрировала ее в 2015 году.

Оказалось, что добавление люмакафтора к ивакафтору несколько улучшало течение болезни у пациентов с гомозиготной мутацией F508del, хотя эффект был не таким сильным, как в случае применения ивакафтора у пациентов с CFTR-G551D. FEV1 улучшался примерно на 5% по сравнению с плацебо, примерно в полтора раза снижалось количество обострений, улучшалось качество жизни [31]. Комбинация оказалась не столь безопасной, как ивакафтор в одиночку: небольшая часть пациентов прекратила прием препарата из-за удушья. Тем не менее эта комбинация позволила охватить около 45% пациентов с муковисцидозом.

Однако параллельно обнаружили, что у пациентов с мутацией F508del ивакафтор вообще несколько снижает эффективность корректоров [36], и, следовательно, требуются новые препараты и комбинации, чтобы повысить эффективность терапии и охватить тех пациентов, кому не подходят существующие лекарства. Кроме того, оказалось, что люмакафтор активирует цитохром CYP3A — белок печени, который отвечает за метаболизм ивакафтора, что снижает эффективность последнего [37].

Компания Vertex не собирается останавливаться: в 2018 году она вывела на рынок новую комбинацию — тезакафтор + ивакафтор («Симдеко», Symdeco). Тезакафтор тоже был обнаружен в ходе высокопроизводительного скрининга 150 000 соединений в 2005 году [38]. В сочетании с ивакафтором на клетках эпителия бронхов, взятых у пациентов с гомозиготной мутацией CFTR-F508del, он продемонстрировал повышение транспорта хлорида до 15,7% от нормального. Также было показано, что комбинация увеличивает частоту биения ресничек эпителия [39].

В клинических исследованиях Symdeco оказался более эффективным, чем один ивакафтор, а главное — комбинация оказалась совсем безопасной: в группе препарата наблюдалось даже меньше нежелательных явлений, чем в плацебо-группе [31].

По структуре тезакафтор похож на люмакафтор, и в обоих случаях точно не известно, где именно они связываются с CFTR и каков механизм компенсации мутации F508del. Бесценные данные по трехмерной структуре CFTR были получены относительно молодым методом криоэлектронной микроскопии, за который в 2017 году присудили Нобелевскую премию по химии [40].

Механизмы связывания лекарств

Расчеты методом молекулярного докинга позволили предположить, что обе молекулы связываются вблизи С-конца первого трансмембранного домена, как раз в том месте, где он контактирует с доменом NBD1 (рис. 8). В непосредственной близости от сайта связывания находятся остатки F508 и некоторые другие, мутации которых отвечают за неправильное сворачивание CFTR (то есть мутации класса II). Исследователи даже делают предположение, каким образом те или иные части молекул-корректоров компенсируют соответствующие мутации [3]. В дальнейшем такие трехмерные данные, вероятно, позволят разрабатывать новые лекарства от муковисцидоза с улучшенными характеристиками.

Рисунок 8. Трехмерная модель связывания корректоров CFTR в предположительном сайте связывания. а — Зеленым цветом обозначен люмакафтор, сиреневым — тезакафтор. б — Взаимодействие остатка F508 с α-спиралью ICL4 домена NBD1. Находящиеся рядом остатки R1070 и V510 в случае замены их на более объемные могут скомпенсировать дефект сворачивания белка, но не исправляют дефект функции.

Перспективы

Vertex ведет исследования новых, тройных комбинаций, где к комплексу тезакафтора и ивакафтора будет добавляться еще один корректор — VX-659, или VX-445, или VX-152. Эти три молекулы были идентифицированы в ходе скрининга в присутствии тезакафтора. На клетках комбинация каждого из этих веществ увеличивала поток ионов хлора до 68–75% от нормы [42].

Результаты исследования фазы 3 для первой такой комбинации станут известны в конце 2018 года, для второй — в середине 2019. В фазе 2 увеличение FEV1 по сравнению с плацебо для тройной комбинации тезакафтор + ивакафтор + VX-659 составило 13%, что свидетельствует о довольно высокой эффективности комбинации [41].

На более ранней стадии есть у Vertex и совсем новые разработки — в фазе 2 исследуется комбинация потенциатора, корректора и ингибитора ENaC. Разработчики надеются, что, снижая отток ионов натрия с поверхности эпителиальных клеток внутрь, они добьются еще лучшего восстановления слизистого слоя.

Еще одна интересная разработка — дейтерированный ивакафтор, то есть такой, у которого некоторые атомы водорода заменены на более тяжелый изотоп дейтерий (рис. 9). Это не влияет на активность ивакафтора по отношению к CFTR, но делает его более устойчивым к превращениям в организме. В итоге его период полувыведения примерно в полтора раза длиннее, чем у ивакафтора, что позволяет дозировать его один раз в день вместо двух. Сейчас для дейтерированного ивакафтора идут исследования фазы 2 [43].

Рисунок 9. Дейтерирование молекулы увеличивает размер атома водорода и меняет характер ее взаимодействия с некоторыми веществами

На совсем ранней стадии у Vertex есть и генная терапия, использующая систему CRISPR-Cas9 [45], и мРНК, компенсирующая дефекты CFTR. Однако множество провалов в этой области пока не дают основания утверждать, что именно эти подходы сработают.

Заключение

К сожалению, пока в России не зарегистрировано ни одно из новых средств, описанных в данной статье, но, надеемся, ситуация в ближайшие годы изменится.

На примере муковисцидоза интересно проследить взаимовлияние между разными уровнями организации материи: изменение всего нескольких атомов в молекуле белка CFTR отражается на работе клетки, затем ткани, органа и всего организма. А последствием этого является организация социальных структур из сотен людей, которые предпринимают усилия для компенсации дефекта на уровне молекул.

Вылечить муковисцидоз пока невозможно — для этого требуются более совершенные средства генной терапии, чем у нас есть сейчас. Но описанные в этой статье препараты позволяют значительно улучшить жизнь большинства больных. Главная задача — разработка таких средств, которые бы помогали всем пациентам независимо от мутаций CFTR.

Источник