Просвечивающая электронная микроскопия что можно увидеть
Просвечивающая электронная микроскопия
В материаловедении изучаются процессы роста и кристаллизации тонких пленок, структурные превращения в процессе термической обработки и механического воздействия. В полупроводниковой электронике электронный микроскоп используется для визуализации дефектов и тонкой структуры кристаллов и слоев. В биологии – позволяют увидеть и изучить строение отдельных молекул, коллоидов, вирусов, элементы клеток, структуру белков, нуклеиновые кислоты.
Принцип работы просвечивающего электронного микроскопа заключается в следующем (рис. 48).
а
б
Рис. 48 Принципиальная схема ПЭМ: 1 – катод; 2 – анод; 3 – конденсорная линза; 4 – шлюзовая камера с образцом; 5 – объективная линза; 6 – промежуточная линза; 7 – проекционная линза; 8 – флуоресцирующий экран; 9 – фотокамера; 10 – оптический микроскоп
Расположенная в верхней части колонны электронная пушка – система, образованная катодом, анодом и нитью накала, является источником потока электронов. Нагреваемая до температуры 2200 – 2700 ºС нить из вольфрама испускает электроны, которые ускоряются сильным электрическим полем. Для создания такого поля катод 1 поддерживают под потенциалом порядка 100 кВ относительно анода 2 (находится под потенциалом земли). Поскольку электроны сильно рассеиваются молекулами воздуха в колонне микроскопа, создается высокий вакуум. Пройдя сетчатый анод, поток электронов фокусируется магнитными конденсорными линзами 3 в пучок (диаметр сечения 1 – 20 мкм) и попадает на исследуемый образец 4, установленный на мелкой сетке предметного столика. Его конструкция включает шлюзы, позволяющие ввод образца в вакуумную среду микроскопа с минимальным увеличением давления.
Первоначальное увеличение изображения осуществляется объективной линзой 5. Образец помещается в непосредственной близости от фокальной плоскости ее магнитного поля. Для получения большого увеличения и уменьшения фокусного расстояния линзы увеличивают числа витков и для катушки используют магнитопровод из ферромагнитного материала. Объективная линза дает увеличенное изображение объекта (порядка х100). Обладая большой оптической силой, она определяет предельно возможное разрешение прибора.
После прохождения сквозь образец часть электронов рассеивается и задерживается апертурной диафрагмой (толстая металлическая пластина с отверстием, которая устанавливается в задней фокальной плоскости объективной линзы – плоскости первичного дифракционного изображения). Не рассеянные электроны проходят через отверстие диафрагмы и фокусируются объективной линзой в предметной плоскости промежуточной линзы 6, которая служит для получения большего увеличения. Получение изображения объекта обеспечивается проекционной линзой 7. Последняя формирует изображение на люминесцентном экране 8, который светится под воздействием электронов и преобразует электронное изображение в видимое. Это изображение регистрируется фотокамерой 9 либо анализируется с помощью микроскопа 10.
Растровый просвечивающий электронный микроскоп (РПЭМ). Изображение формируется бегущим пучком, а не пучком, освещающим весь исследуемый участок образца. Поэтому требуется высокоинтенсивный источник электронов, чтобы изображение можно было зарегистрировать за приемлемое время. В РПЭМ высокого разрешения используются автоэлектронные эмиттеры высокой яркости. В таком источнике электронов создается очень сильное электрическое поле (
10 8 В/см) вблизи поверхности заостренной травлением вольфрамовой проволочки очень малого диаметра, благодаря чему электроны легко покидают металл. Интенсивность свечения (яркость) такого источника почти в 10 000 раз больше, чем источника с нагреваемой вольфрамовой проволокой, а испускаемые им электроны могут быть сфокусированы в пучок диаметром около 0.2 нм.
Рис. 49. Схема растрового просвечивающего электронного микроскопа: 1 – электронная пушка; 2 – ускоряющая система (анод): 3 – магнитная линза; 4 – отклоняющая магнитная система; 5 – образец; 6 – кольцевой детектор; 7 – анализатор энергии электронов
Исследования в РПЭМ проводятся на сверхтонких образцах. Электроны, испускаемые электронной пушкой 1, ускоряясь сильным электрическим полем анода 2, проходят через него и фокусируются магнитной линзой 3 на образец 5. Далее сформированный таким образом электронный пучок проходит сквозь тонкий образец почти без рассеяния. При этом с помощью отклоняющей магнитной системы 4 электронный пучок последовательно отклоняется на заданный угол от первоначального положения и сканирует поверхность образца.
Электроны, рассеянные на углы более нескольких градусов без замедления, регистрируются, попадая на кольцевой электрод 6, расположенный под образцом. Сигнал, снимаемый с этого электрода, сильно зависит от атомного номера атомов в той области, через которую проходят электроны, – более тяжелые атомы рассеивают больше электронов в направлении детектора, чем легкие. Если электронный пучок сфокусирован в точку диаметром менее 0.5 нм, то можно получить изображение отдельных атомов. Электроны, не претерпевшие рассеяния в образце, а также электроны, замедлившиеся в результате взаимодействия с образцом, проходят в отверстие кольцевого детектора. Энергетический анализатор 7, расположенный под этим детектором, позволяет отделить первые от вторых. Потери энергии, связанные с возбуждением рентгеновского излучения или выбиванием вторичных электронов из образца, позволяют судить о химических свойствах вещества в области, через которую проходит электронный пучок.
Контраст в ПЭМ обусловлен рассеянием электронов при прохождении электронного пучка через образец. Одни из прошедших через образец электронов рассеиваются из-за столкновений с ядрами атомов образца, другие – из-за столкновений с электронами атомов, а третьи проходят, не претерпевая рассеяния. Степень рассеяния в какой-либо области образца зависит от толщины образца в этой области, его плотности и средней атомной массы (числа протонов) в данной точке.
Разрешающая способность ЭМ определяется эффективной длиной волны электронов. Чем больше ускоряющее напряжение, тем больше скорость электронов и тем меньше длина волны, а значит, выше разрешение. Значительное преимущество ЭМ в разрешающей способности объясняется тем, что длина волны электронов намного меньше длины волны света.
Для проведения локального спектрального анализа элементного состава рентгеновское характеристическое излучение из облучаемой точки образца регистрируется кристаллическим или полупроводниковым спектрометрами. Кристаллический спектрометр с помощью кристалла-анализатора разлагает с высоким спектральным разрешением рентгеновское излучение по длинам волн, перекрывая диапазон элементов от Be до U.
а
б
Рис. 50. Изображения, полученные с помощью растрового электронного микроскопа: а – голова мухи в РЭМ; б – микротрещина в стали после испытаний на прочность;
Просвечивающие микроскопы: принцип работы и преимущества
Рубрика: На правах рекламы
Дата публикации: 21.11.2020 2020-11-21
Статья просмотрена: 1168 раз
Библиографическое описание:
Просвечивающий микроскоп был разработан в 50-х годах 20 столетия. Вместо света в просвечивающем электронном микроскопе используется сфокусированный электронный луч, который направляется через образец для формирования изображения. По сравнению с оптическими микроскопами преимущество просвечивающих микроскопов заключается в том, что они могут производить более высокое увеличение и отображать детали, которые не могут быть получены с помощью оптических приборов.
Просвечивающие микроскопы используются для визуализации биологических образцов с максимальным разрешением 0,1–0,2 нанометра (нм). Хотя ни один микроскоп не является «идеальным» для каждой отдельной лабораторной задачи, просвечивающие микроскопы обладают множеством особых преимуществ. Эти устройства исключительно полезны для визуализации тонких срезов образцов и демонстрации тонкостей его ультраструктуры. В данной статье подробнее о том, где применяются просвечивающие микроскопы и их основных преимуществах.
Просвечивающие микроскопы работают аналогично оптическим, но в них используются электронные лучи вместо света или фотонов. Электронная пушка – это источник электронов, и ее функция аналогична источнику света в оптическом микроскопе. Отрицательно заряженные электроны притягиваются к аноду, который представляет собой положительно заряженное кольцевое устройство. Когда электроны проходят через вакуум внутри микроскопа, магнитная линза фокусирует поток электронов. Эти сфокусированные электроны попадают на образец на предметный столик и отражаются от образца, генерируя рентгеновские лучи. Отраженные или рассеянные электроны и рентгеновские лучи преобразуются в сигналы, которые передают изображение на экран, где ученый исследует образец.
Преимущества просвечивающих микроскопов.
Просвечивающие микроскопы считаются идеальными устройствами для визуализации. Технология позволяет рассмотреть молекулы и вирусы. Вирионы или целые вирусы обычно имеют размер от 20 до 300 нм, хотя некоторые гигантские штаммы вирусов могут иметь длину до 1400 нм. Из-за возможности высокого разрешения устройства становятся возможны жизненно важные визуализации новых клеточных органелл и ассоциаций между ними. В медицине они показывают динамику, которая происходит между человеческими клетками, бактериями, паразитами и вирусами. Например, именно трансмиссионная микроскопия позволяет лучше понять развитие форм малярийного паразита и то, как именно он взаимодействует с нашими клетками. Как выглядят вирусы, и как они взаимодействуют с поверхностными клетками.
Криотрансмиссионная микроскопия – это отрасль просвечивающей электронной микроскопии, которая имеет большое значение в структурной биологии, поскольку не требует фиксации или окрашивания для правильного изображения образца. Это выгодно, так как позволяет визуализировать образец в его естественной среде, что в противном случае невозможно в стандартных препаратах для просвечивающего электронного микроскопа.
И наконец, ключевым преимуществом технологии просвечивающего электронного микроскопа является наличие методов, которые позволяют визуализировать внутренние структуры. Таким образом, этот метод в сочетании с электронной микроскопией имеет большое значение для понимания содержания липидов, белков и углеводов в клеточной мембране.
Сегодня просвечивающие микроскопы стали необходимостью для изучения биологических и молекулярных ультраструктур, некоторые университеты сотрудничают, чтобы иметь доступ к этому оборудованию. Абсолютная детализация и точность изображения, которые стали возможны с помощью этих микроскопов, делают их уникальным продуктом в арсенале структурных и молекулярных биологов.
Одна из трудностей просвечивающей электронной микроскопии с высоким разрешением состоит в том, что формирование изображения зависит от фазового контраста. При фазово-контрастной визуализации контраст не поддается интуитивной интерпретации, поскольку на изображение влияют аберрации формирующих изображение линз в микроскопе. Наибольший вклад в неисправленные инструменты обычно вносят расфокусировка и астигматизм. Последнее можно оценить по так называемому кольцевому шаблону Тона, появляющемуся в модуле преобразования Фурье изображения тонкой аморфной пленки.
СОДЕРЖАНИЕ
Контраст изображения и интерпретация
Контраст изображения, полученного с помощью просвечивающей электронной микроскопии с высоким разрешением, возникает из-за интерференции плоскости изображения электронной волны с самой собой. Из-за нашей неспособности записать фазу электронной волны записывается только амплитуда в плоскости изображения. Однако большая часть структурной информации образца содержится в фазе электронной волны. Чтобы обнаружить это, аберрации микроскопа (например, дефокус) должны быть настроены таким образом, чтобы фаза волны в выходной плоскости образца преобразуется в амплитуды в плоскости изображения.
Передаточная функция фазового контраста
Последний синусоидальный член передаточной функции контраста будет определять знак, с которым компоненты частоты u будут входить в контраст в конечном изображении. Если учесть только сферическую аберрацию до третьего порядка и дефокусировку, χ вращательно симметричен относительно оптической оси микроскопа и, таким образом, зависит только от модуля u = | u |, задаваемый
Функция апертуры отсекает лучи, рассеянные выше определенного критического угла (например, заданного полюсным наконечником объектива), тем самым эффективно ограничивая достижимое разрешение. Однако именно огибающая функция E ( u ) обычно ослабляет сигнал лучей, рассеянных под большими углами, и накладывает максимум на передаваемую пространственную частоту. Этот максимум определяет наивысшее разрешение, достижимое с помощью микроскопа, и известно как предел информации. E ( u ) можно описать как произведение отдельных конвертов:
E s ( u ) : угловой разброс источника E c ( u ) : хроматическая аберрация E d ( u ) : дрейф образца E v ( u ) : вибрация образца E D ( u ) : детектор
Функция временной огибающей может быть выражена как
Информационный предел современных просвечивающих электронных микроскопов значительно ниже 1 Å. Проект TEAM в Национальной лаборатории Лоуренса Беркли привел к созданию первого просвечивающего электронного микроскопа, который в 2009 году достиг предела информации Оптимальная расфокусировка в просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения
Выбор оптимальной расфокусировки имеет решающее значение для полного использования возможностей электронного микроскопа в режиме просвечивающей электронной микроскопии с высоким разрешением. Однако нет однозначного ответа, какой из них лучше.
Расфокусировка Шерцера
Габор расфокусировать
Расфокусировка Габора используется в электронной голографии, где регистрируются как амплитуда, так и фаза волны изображения. Таким образом, нужно свести к минимуму перекрестные помехи между ними. Расфокусировка Габора может быть выражена как функция расфокусировки Шерцера как
Δ ж Габор знак равно 0,56 Δ ж Scherzer <\ displaystyle \ Delta f _ <\ text 
Расфокусировка Лихте
Реконструкция выходной волны
Однако сначала необходимо измерить фазу и амплитуду электронной волны в плоскости изображения. Поскольку наши инструменты регистрируют только амплитуды, необходимо использовать альтернативный метод восстановления фазы. Сегодня используются два метода:
Оба метода расширяют точечное разрешение микроскопа за предел информации, который является максимально возможным разрешением, достижимым на данной машине. Идеальная величина расфокусировки для этого типа изображения известна как дефокус Лихте и обычно составляет несколько сотен нанометров отрицательной величины.
Просвечивающая электронная микроскопия
Просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия (ПЭМ) использует волновые свойства движущихся электронов с целью получать изображения изучаемого объекта с высоким разрешением. Электроны, вылетающие из электронной пушки, проходят через конденсорные линзы, которые фокусируют электроны на объекте. Пучок электронов проходит сквозь образец. Линзы объектива и линзы проектора увеличивают прошедший луч и проецируют его на люминесцентный экран. Удары электронов возбуждают экран и создают видимое увеличенное изображение образца. Изображение регистрируется различными детекторами. Пространственное разрешение ПЭМ достигает 0,1 нм (1 Ǻ) при ускоряющем напряжении 50—600 кВ.
. 
Рис. 30. Современный просвечивающий электронный микроскоп (фирмы ZEISS).
Рис. 31. Общая схема просвечивающего электронного микроскопа.
Обычными источниками электронов являются термоионные электронные пушки или пушки автоэлектронной эмиссии.
Рис. 32. Термоионная электронная пушка.
Для пучка света, проходящего сквозь оптическую систему, произведение площади на пространственный апертурный угол остается величиной постоянной. Таким образом, используя лишь большой апертурный угол оптической системы, крупный источник можно сфокусировать в небольшое пятнышко. Но поскольку апертурные углы у электронных линз ограничены, то для того, чтобы получить яркое изображение образца, требуются источники малого размера и высокой яркости.
Важнейшей частью ПЭМ являются электронные линзы. Линзы используются для собирания лучей исходящих из точки объекта и создают точку в изображении, а также для фокусирования лучей в точку на фокальной плоскости линзы. Существуют линзы магнитные, электростатические и линзы смешанного типа. Некоторые характеристики, такие как фокусная длина, сферическая аберрация и хроматическая аберрация, практически одинаковы у электронных и оптических линз.
Сферическая аберрация. Этот дефект связан с неидеальным действием на лучи, идущие вдали от оптической оси. Чем дальше от оси движется электрон, тем сильнее он отклоняется по направлению к оси. В результате точка изображается в виде диска конечного размера.
Хроматическая аберрация. Этот дефект связан с немонохроматичностью электронов, и с разным отклонением в электромагнитном поле электронов, отличающихся энергией. Электроны с более низкими энергиями, отклоняются на больший угол. При таком энергетическом разбросе хроматическая аберрация не представляет проблему. Однако вследствие неупругих процессов спектр электронов «размывается» после прохождения образца.
Вакуумная система ПЭМ. В ПЭМ постоянно поддерживается высокий вакуум, давление внутри колонны
1. Форвакуумный насосиспользуется для получения чернового вакуума. Необходимо предпринимать меры, чтобы механические вибрации, сопутствующие работе этого насоса не передавались на инструмент. Кроме того, трубопроводы, соединяющие насос с микроскопом, должны иметь эффективно работающие ловушки (конденсирующие или адсорбирующие) для паров масла, являющегося рабочей жидкостью в форнасосах.
Рис. 33. Общая схема форвакуумного (А) и диффузионного насоса (Б).
Выхлопные газы должны выводиться из рабочего помещения.
2. Диффузионный насос. Рабочей средой является синтетические масла (полиэфирные) с низким давлением насыщенных паров. Для дальнейшего подавления проникновения паров в вакуумную систему используют охлаждаемые жидким азотом ловушки, разделяющие диффузионный насос и ПЭМ. Диффузионные насосы способны обеспечивать вакуум в диапазоне от
3. Турбомолекулярный насос. Основной его частью является турбина, вращающаяся со скоростью 10000-50000 оборотов в минуту. Такие насосы не содержат масла, практически бесшумны и не создают вибрации. Турбомолекулярный насос может стартовать с атмосферного давления, медленно разгоняясь по мере улучшения вакуума, что важно для UHV систем, т.к. она становится безмаслянной.
Рис. 34. Общая схема турбомолекулярного (А) и ионного насоса (Б).
Держатель образцов. Исследуемый образец крепится на держателе (specimen holder) и транспортируется через шлюз гониометра в поле объектной линзы. Держатель обеспечивает перемещение образца по осям и его вращение. Держатель может быть снабжен устройством нагрева, охлаждения, механических нагрузок и одновременно обеспечивает высокий вакуум. В современных ПЭМ наиболее часто используются держатели с боковой загрузкой. Они дают возможность большей свободы механической манипуляции образцом и реализации in-situ исследований эволюции физическо-химических свойств образца.
ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП
ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП, прибор, который позволяет получать сильно увеличенное изображение объектов, используя для их освещения электроны. Электронный микроскоп (ЭМ) дает возможность видеть детали, слишком мелкие, чтобы их мог разрешить световой (оптический) микроскоп. ЭМ – один из важнейших приборов для фундаментальных научных исследований строения вещества, особенно в таких областях науки, как биология и физика твердого тела.
Существуют три основных вида ЭМ. В 1930-х годах был изобретен обычный просвечивающий электронный микроскоп (ОПЭМ), в 1950-х годах – растровый (сканирующий) электронный микроскоп (РЭМ), а в 1980-х годах – растровый туннельный микроскоп (РТМ). Эти три вида микроскопов дополняют друг друга в исследованиях структур и материалов разных типов.
ОБЫЧНЫЙ ПРОСВЕЧИВАЮЩИЙ ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП
Электронная оптика.
Электронное изображение формируется электрическими и магнитными полями примерно так же, как световое – оптическими линзами. Принцип действия магнитной линзы поясняется схемой (рис. 1). Магнитное поле, создаваемое витками катушки, по которой проходит ток, действует как собирающая линза, фокусное расстояние которой можно изменять, изменяя ток. Поскольку оптическая сила такой линзы, т.е. способность фокусировать электроны, зависит от напряженности магнитного поля вблизи оси, для ее увеличения желательно сконцентрировать магнитное поле в минимально возможном объеме. Практически это достигается тем, что катушку почти полностью закрывают магнитной «броней» из специального никель-кобальтового сплава, оставляя лишь узкий зазор в ее внутренней части. Создаваемое таким образом магнитное поле может быть в 10–100 тыс. раз более сильным, чем магнитное поле Земли на земной поверхности.
Схема ОПЭМ представлена на рис. 2. Ряд конденсорных линз (показана лишь последняя) фокусирует электронный пучок на образце. Обычно первая из них создает неувеличенное изображение источника электронов, а последняя контролирует размер освещаемого участка на образце. Диафрагмой последней конденсорной линзы определяется ширина пучка в плоскости объекта. Образец помещается в магнитном поле объективной линзы с большой оптической силой – самой важной линзы ОПЭМ, которой определяется предельное возможное разрешение прибора. Аберрации объективной линзы ограничиваются ее диафрагмой так же, как это происходит в фотоаппарате или световом микроскопе. Объективная линза дает увеличенное изображение объекта (обычно с увеличением порядка 100); дополнительное увеличение, вносимое промежуточными и проекционной линзами, лежит в пределах величин от несколько меньшей 10 до несколько большей 1000. Таким образом, увеличение, которое можно получить в современных ОПЭМ, составляет от менее 1000 до
1 000 000. (При увеличении в миллион раз грейпфрут вырастает до размеров Земли.) Исследуемый объект обычно помещают на очень мелкую сетку, вкладываемую в специальный держатель. Держатель можно механическим или электрическим способом плавно перемещать вверх-вниз и вправо-влево.
Изображение.
Контраст в ОПЭМ обусловлен рассеянием электронов при прохождении электронного пучка через образец. Если образец достаточно тонок, то доля рассеянных электронов невелика. При прохождении электронов через образец одни из них рассеиваются из-за столкновений с ядрами атомов образца, другие – из-за столкновений с электронами атомов, а третьи проходят, не претерпевая рассеяния. Степень рассеяния в какой-либо области образца зависит от толщины образца в этой области, его плотности и средней атомной массы (числа протонов) в данной точке. Электроны, выходящие из диафрагмы с угловым отклонением, превышающим некоторый предел, уже не могут вернуться в пучок, несущий изображение, а поэтому сильно рассеивающие участки повышенной плотности, увеличенной толщины, места расположения тяжелых атомов выглядят на изображении как темные зоны на светлом фоне. Такое изображение называется светлопольным, поскольку на нем окружающее поле светлее объекта. Но можно сделать так, чтобы электрическая отклоняющая система пропускала в диафрагму объектива только те или иные из рассеянных электронов. Тогда образец выглядит светлым на темном поле. Слабо рассеивающий объект часто бывает удобнее рассматривать в режиме темного поля.
Окончательное увеличенное электронное изображение преобразуется в видимое посредством люминесцентного экрана, который светится под действием электронной бомбардировки. Это изображение, обычно слабоконтрастное, как правило, рассматривают через бинокулярный световой микроскоп. При той же яркости такой микроскоп с увеличением 10 может создавать на сетчатке глаза изображение, в 10 раз более крупное, чем при наблюдении невооруженным глазом. Иногда для повышения яркости слабого изображения применяется люминофорный экран с электронно-оптическим преобразователем. В этом случае окончательное изображение может быть выведено на обычный телевизионный экран, что позволяет записать его на видеоленту. Видеозапись применяется для регистрации изображений, меняющихся во времени, например, в связи с протеканием химической реакции. Чаще всего окончательное изображение регистрируется на фотопленке или фотопластинке. Фотопластинка обычно позволяет получить более четкое изображение, чем наблюдаемое простым глазом или записанное на видеоленте, так как фотоматериалы, вообще говоря, более эффективно регистрируют электроны. Кроме того, на единице площади фотопленки может быть зарегистрировано в 100 раз больше сигналов, чем на единице площади видеоленты. Благодаря этому изображение, зарегистрированное на фотопленке, можно дополнительно увеличить примерно в 10 раз без потери четкости.
Разрешение.
Электронные пучки имеют свойства, аналогичные свойствам световых пучков. В частности, каждый электрон характеризуется определенной длиной волны. Разрешающая способность ЭМ определяется эффективной длиной волны электронов. Длина волны зависит от скорости электронов, а следовательно, от ускоряющего напряжения; чем больше ускоряющее напряжение, тем больше скорость электронов и тем меньше длина волны, а значит, выше разрешение. Столь значительное преимущество ЭМ в разрешающей способности объясняется тем, что длина волны электронов намного меньше длины волны света. Но поскольку электронные линзы не так хорошо фокусируют, как оптические (числовая апертура хорошей электронной линзы составляет всего лишь 0,09, тогда как для хорошего оптического объектива эта величина достигает 0,95), разрешение ЭМ равно 50–100 длинам волн электронов. Даже со столь слабыми линзами в электронном микроскопе можно получить предел разрешения ок. 0,17 нм, что позволяет различать отдельные атомы в кристаллах. Для достижения разрешения такого порядка необходима очень тщательная настройка прибора; в частности, требуются высокостабильные источники питания, а сам прибор (который может быть высотой ок. 2,5 м и иметь массу в несколько тонн) и его дополнительное оборудование требуют монтажа, исключающего вибрацию.
РАСТРОВЫЙ ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП
РЭМ, ставший важнейшим прибором для научных исследований, служит хорошим дополнением ОПЭМ. В РЭМ применяются электронные линзы для фокусировки электронного пучка в пятно очень малых размеров. Можно отрегулировать РЭМ так, чтобы диаметр пятна в нем не превышал 0,2 нм, но, как правило, он составляет единицы или десятки нанометров. Это пятно непрерывно обегает некоторый участок образца аналогично лучу, обегающему экран телевизионной трубки. Электрический сигнал, возникающий при бомбардировке объекта электронами пучка, используется для формирования изображения на экране телевизионного кинескопа или электронно-лучевой трубки (ЭЛТ), развертка которой синхронизирована с системой отклонения электронного пучка (рис. 3). Увеличение в данном случае понимается как отношение размера изображения на экране к размеру области, обегаемой пучком на образце. Это увеличение составляет от 10 до 10 млн.
Взаимодействие электронов сфокусированного пучка с атомами образца может приводить не только к их рассеянию, которое используется для получения изображения в ОПЭМ, но и к возбуждению рентгеновского излучения, испусканию видимого света и эмиссии вторичных электронов. Кроме того, поскольку в РЭМ перед образцом имеются только фокусирующие линзы, он позволяет исследовать «толстые» образцы.
Отражательный РЭМ.
Отражательный РЭМ предназначен для исследования массивных образцов. Поскольку контраст, возникающий при регистрации отраженных, т.е. обратно-рассеянных, и вторичных электронов, связан в основном с углом падения электронов на образец, на изображении выявляется поверхностная структура. (Интенсивность обратного рассеяния и глубина, на которой оно происходит, зависят от энергии электронов падающего пучка. Эмиссия вторичных электронов определяется, в основном составом поверхности и электропроводностью образца.) Оба эти сигнала несут информацию об общих характеристиках образца. Благодаря малой сходимости электронного пучка можно проводить наблюдения с гораздо большей глубиной резкости, чем при работе со световым микроскопом, и получать прекрасные объемные микрофотографии поверхностей с весьма развитым рельефом. Регистрируя рентгеновское излучение, испускаемое образцом, можно в дополнение к данным о рельефе получать информацию о химическом составе образца в поверхностном слое глубиной
0,001 мм. О составе материала на поверхности можно судить и по измеренной энергии, с которой эмиттируются те или иные электроны.
Все сложности работы с РЭМ обусловлены, в основном, его системами регистрации и электронной визуализации. В приборе с полным комплексом детекторов, наряду со всеми функциями РЭМ, предусматривается рабочий режим электронно-зондового микроанализатора.
Растровый просвечивающий электронный микроскоп.
Растровый просвечивающий электронный микроскоп (РПЭМ) – это особый вид РЭМ. Он рассчитан на тонкие образцы, такие же, как и исследуемые в ОПЭМ. Схема РПЭМ отличается от схемы на рис. 3 только тем, что в ней нет детекторов, расположенных выше образца. Поскольку изображение формируется бегущим пучком (а не пучком, освещающим весь исследуемый участок образца), требуется высокоинтенсивный источник электронов, чтобы изображение можно было зарегистрировать за приемлемое время. В РПЭМ высокого разрешения используются автоэлектронные эмиттеры высокой яркости. В таком источнике электронов создается очень сильное электрическое поле (ок. 
В/см) вблизи поверхности заостренной травлением вольфрамовой проволочки очень малого диаметра. Это поле буквально вытягивает миллиарды электронов из проволочки без всякого нагрева. Яркость такого источника почти в 10 000 раз больше, чем источника с нагреваемой вольфрамовой проволокой (см. выше), а испускаемые им электроны могут быть сфокусированы в пучок диаметром менее 1 нм. Были даже получены пучки, диаметр которых близок к 0,2 нм.
Автоэлектронные источники могут работать только в условиях сверхвысокого вакуума (при давлениях ниже 
Па), в которых полностью отсутствуют такие загрязнения, как пары углеводородов и воды, и становится возможным получение изображений с высоким разрешением. Благодаря таким сверхчистым условиям можно исследовать процессы и явления, недоступные ЭМ с обычными вакуумными системами.
Исследования в РПЭМ проводятся на сверхтонких образцах. Электроны проходят сквозь такие образцы почти без рассеяния. Электроны, рассеянные на углы более нескольких градусов без замедления, регистрируются, попадая на кольцевой электрод, расположенный под образцом (рис. 3). Сигнал, снимаемый с этого электрода, сильно зависит от атомного номера атомов в той области, через которую проходят электроны, – более тяжелые атомы рассеивают больше электронов в направлении детектора, чем легкие. Если электронный пучок сфокусирован в точку диаметром менее 0,5 нм, то можно получить изображение отдельных атомов. Реально удается различать на изображении, полученном в РПЭМ, отдельные атомы с атомной массой железа (т.е. 26 и более).
Электроны, не претерпевшие рассеяния в образце, а также электроны, замедлившиеся в результате взаимодействия с образцом, проходят в отверстие кольцевого детектора. Энергетический анализатор, расположенный под этим детектором, позволяет отделить первые от вторых. Измеряя энергию, потерянную электронами при рассеянии, можно получить важную информацию об образце. Потери энергии, связанные с возбуждением рентгеновского излучения или выбиванием вторичных электронов из образца, позволяют судить о химических свойствах вещества в области, через которую проходит электронный пучок.
РАСТРОВЫЙ ТУННЕЛЬНЫЙ МИКРОСКОП
В ЭМ, рассмотренных выше, для фокусировки электронов применяются магнитные линзы. Данный раздел посвящен ЭМ без линз. Но, прежде чем переходить к растровому туннельному микроскопу (РТМ), будет полезно кратко остановиться на двух старых видах безлинзового микроскопа, в которых формируется проецированное теневое изображение.
Автоэлектронный и автоионный проекторы.
Автоэлектронный источник, применяемый в РПЭМ, с начала 1950-х годов применялся в теневых проекторах. В автоэлектронном проекторе электроны, испускаемые за счет автоэлектронной эмиссии острием очень малого диаметра, ускоряются в направлении люминесцентного экрана, расположенного на расстоянии нескольких сантиметров от острия. В результате на экране возникает проецированное изображение поверхности острия и находящихся на этой поверхности частиц с увеличением, равным отношению радиуса экрана к радиусу острия (порядка 
). Более высокое разрешение достигается в автоионном проекторе, в котором проецирование изображения осуществляется ионами гелия (или некоторых других элементов), эффективная длина волны которых меньше, чем у электронов. Это позволяет получать изображения, показывающие истинное расположение атомов в кристаллической решетке материала острия. Поэтому автоионные проекторы используются, в частности, для исследования кристаллической структуры и ее дефектов в материалах, из которых могут быть изготовлены такие острия.
Растровый туннельный микроскоп (РТМ).
В этом микроскопе тоже используется металлическое острие малого диаметра, являющееся источником электронов. В зазоре между острием и поверхностью образца создается электрическое поле. Число электронов, вытягиваемых полем из острия в единицу времени (ток туннелирования), зависит от расстояния между острием и поверхностью образца (на практике это расстояние меньше 1 нм). При перемещении острия вдоль поверхности ток модулируется. Это позволяет получить изображение, связанное с рельефом поверхности образца. Если острие заканчивается одиночным атомом, то можно сформировать изображение поверхности, проходя атом за атомом.
РТМ может работать только при условии, что расстояние от острия до поверхности постоянно, а острие можно перемещать с точностью до атомных размеров. Вибрации подавляются благодаря жесткой конструкции и малым размерам микроскопа (не более кулака), а также применению многослойных резиновых амортизаторов. Высокую точность обеспечивают пьезоэлектрические материалы, которые удлиняются и сокращаются под действием внешнего электрического поля. Подавая напряжение порядка 10 –5 В, можно изменять размеры таких материалов на 0,1 нм и менее. Это дает возможность, закрепив острие на элементе из пьезоэлектрического материала, перемещать его в трех взаимно перпендикулярных направлениях с точностью порядка атомных размеров.
ТЕХНИКА ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Вряд ли остался какой-либо сектор исследований в области биологии и материаловедения, где бы не применялась просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ); это обеспечено успехами техники приготовления образцов.
Все применяемые в электронной микроскопии методики нацелены на получение предельно тонкого образца и обеспечение максимального контраста между ним и подложкой, которая необходима ему в качестве опоры. Основная методика рассчитана на образцы толщиной 2–200 нм, поддерживаемые тонкими пластмассовыми или углеродными пленками, которые кладутся на сетку с размером ячейки ок. 0,05 мм. (Подходящий образец, каким бы способом он ни был получен, обрабатывается так, чтобы увеличить интенсивность рассеяния электронов на исследуемом объекте.) Если контраст достаточно велик, то глаз наблюдателя может без напряжения различить детали, находящиеся на расстоянии 0,1–0,2 мм друг от друга. Следовательно, для того, чтобы на изображении, создаваемом электронным микроскопом, были различимы детали, разделенные на образце расстоянием в 1 нм, необходимо полное увеличение порядка 100–200 тыс. Лучшие из микроскопов могут создать на фотопластинке изображение образца с таким увеличением, но при этом изображается слишком малый участок. Обычно делают микроснимок с меньшим увеличением, а затем увеличивают его фотографически. Фотопластинка разрешает на длине 10 см ок. 10 000 линий. Если каждая линия соответствует на образце некой структуре протяженностью 0,5 нм, то для регистрации такой структуры необходимо увеличение не менее 20 000, тогда как при помощи РЭМ и РПЭМ, в которых изображение регистрируется электронной системой и развертывается на телевизионном экране, может быть разрешено только ок. 1000 линий. Таким образом, при использовании телевизионного монитора минимально необходимое увеличение примерно в 10 раз больше, чем при фоторегистрации.
Биологические препараты.
Электронная микроскопия широко применяется в биологических и медицинских исследованиях. Разработаны методики фиксации, заливки и получения тонких срезов тканей для исследования в ОПЭМ и РПЭМ и методики фиксации для исследования объемных образцов в РЭМ. Эти методики дают возможность исследовать организацию клеток на макромолекулярном уровне. Электронная микроскопия выявила компоненты клетки и детали строения мембран, митохондрий, эндоплазматической сети, рибосом и множества других органелл, входящих в состав клетки. Образец сначала фиксируют глутаральдегидом или другими фиксирующими веществами, а затем обезвоживают и заливают пластмассой. Методы криофиксации (фиксации при очень низких – криогенных – температурах) позволяют сохранить структуру и состав без использования химических фиксирующих веществ. Кроме того, криогенные методы позволяют получать изображения замороженных биологических образцов без их обезвоживания. При помощи ультрамикротомов с лезвиями из полированного алмаза или сколотого стекла можно делать срезы тканей толщиной 30–40 нм. Смонтированные гистологические препараты могут быть окрашены соединениями тяжелых металлов (свинца, осмия, золота, вольфрама, урана) для усиления контраста отдельных компонентов или структур.
Биологические исследования были распространены на микроорганизмы, особенно на вирусы, которые не разрешаются световыми микроскопами. ПЭМ позволила выявить, например, структуры бактериофагов и расположение субъединиц в белковых оболочках вирусов. Кроме того, методами позитивного и негативного окрашивания удалось выявить структуру с субъединицами в ряде других важных биологических микроструктур. Методы усиления контраста нуклеиновых кислот позволили наблюдать одно- и двунитные ДНК. Эти длинные линейные молекулы распластывают в слой основного белка и накладывают на тонкую пленку. Затем на образец вакуумным напылением наносят очень тонкий слой тяжелого металла. Этот слой тяжелого металла «оттеняет» образец, благодаря чему последний при наблюдении в ОПЭМ или РПЭМ выглядит как бы освещенным с той стороны, с которой напылялся металл. Если же вращать образец во время напыления, то металл накапливается вокруг частиц со всех сторон равномерно (как снежный ком).
Небиологические материалы.
ПЭМ применяется в исследованиях материалов для изучения тонких кристаллов и границ между разными материалами. Чтобы получить изображение границы раздела с большим разрешением, образец заливают пластмассой, делают срез образца, перпендикулярный границе, а затем утоньшают его так, чтобы граница была видна на заостренной кромке. Кристаллическая решетка сильно рассеивает электроны в определенных направлениях, давая дифракционную картину. Изображение кристаллического образца в значительной мере определяется этой картиной; контраст сильно зависит от ориентации, толщины и совершенства кристаллической решетки. Изменения контраста на изображении позволяют изучать кристаллическую решетку и ее несовершенства в масштабе атомных размеров. Получаемая при этом информация дополняет ту, которую дает рентгенографический анализ объемных образцов, так как ЭМ дает возможность непосредственно видеть во всех деталях дислокации, дефекты упаковки и границы зерен. Кроме того, в ЭМ можно снимать электронограммы и наблюдать картины дифракции от выделенных участков образца. Если диафрагму объектива настроить так, чтобы через нее проходили только один дифрагированный и нерассеянный центральный пучки, то можно получать изображение определенной системы кристаллических плоскостей, которая дает этот дифрагированный пучок. Современные приборы позволяют разрешать периоды решетки величиной 0,1 нм. Исследовать кристаллы можно также методом темнопольного изображения, при котором перекрывают центральный пучок, так что изображение формируется одним или несколькими дифрагированными пучками. Все эти методы дали важную информацию о структуре очень многих материалов и существенно прояснили физику кристаллов и их свойства. Например, анализ ПЭМ-изображений кристаллической решетки тонких малоразмерных квазикристаллов в сочетании с анализом их электронограмм позволил в 1985 открыть материалы с симметрией пятого порядка.
Высоковольтная микроскопия.
В настоящее время промышленность выпускает высоковольтные варианты ОПЭМ и РПЭМ с ускоряющим напряжением от 300 до 400 кВ. Такие микроскопы имеют более высокую проникающую способность, чем у низковольтных приборов, причем почти не уступают в этом отношении микроскопам с напряжением 1 млн. вольт, которые строились в прошлом. Современные высоковольтные микроскопы достаточно компактны и могут быть установлены в обычном лабораторном помещении. Их повышенная проникающая способность оказывается очень ценным свойством при исследовании дефектов в более толстых кристаллах, особенно таких, из которых невозможно сделать тонкие образцы. В биологии их высокая проникающая способность дает возможность исследовать целые клетки, не разрезая их. Кроме того, с помощью таких микроскопов можно получать объемные изображения толстых объектов.
Низковольтная микроскопия.
Выпускаются также РЭМ с ускоряющим напряжением, составляющим всего несколько сот вольт. Даже при столь низких напряжениях длина волны электронов меньше 0,1 нм, так что пространственное разрешение и здесь ограничивается аберрациями магнитных линз. Однако, поскольку электроны с такой низкой энергией проникают неглубоко под поверхность образца, почти все электроны, участвующие в формировании изображения, приходят из области, расположенной очень близко к поверхности, благодаря чему повышается разрешение поверхностного рельефа. С помощью низковольтных РЭМ были получены изображения на твердых поверхностях объектов размером менее 1 нм.
Радиационное повреждение.
Поскольку электроны представляют собой ионизирующее излучение, образец в ЭМ постоянно подвергается его воздействию. (В результате этого воздействия возникают вторичные электроны, используемые в РЭМ.) Следовательно, образцы всегда подвергаются радиационному повреждению. Типичная доза излучения, поглощаемая тонким образцом за время регистрации микрофотографии в ОПЭМ, примерно соответствует энергии, которой было бы достаточно для полного испарения холодной воды из пруда глубиной 4 м с площадью поверхности 1 га. Чтобы уменьшить радиационное повреждение образца, необходимо использовать различные методы его подготовки: окрашивание, заливку, замораживание. Кроме того, можно регистрировать изображение при дозах электронов, в 100–1000 раз меньших, нежели по стандартной методике, а затем улучшать его методами компьютерной обработки изображений.
ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА
История создания электронного микроскопа – замечательный пример того, как самостоятельно развивающиеся области науки и техники могут, обмениваясь полученной информацией и объединяя усилия, создавать новый мощный инструмент научных исследований. Вершиной классической физики была теория электромагнитного поля, которая объяснила распространение света, возникновение электрических и магнитных полей, движение заряженных частиц в этих полях как распространение электромагнитных волн. Волновая оптика сделала понятными явление дифракции, механизм формирования изображения и игру факторов, определяющих разрешение, в световом микроскопе. Успехам в области теоретической и экспериментальной физики мы обязаны открытием электрона с его специфическими свойствами. Эти отдельные и, казалось бы, независимые пути развития привели к созданию основ электронной оптики, одним из важнейших приложений которой являлось изобретение ЭМ в 1930-х годах. Прямым намеком на такую возможность можно считать гипотезу о волновой природы электрона, выдвинутую в 1924 Луи де Бройлем и экспериментально подтвержденную в 1927 К.Дэвиссоном и Л.Джермером в США и Дж.Томсоном в Англии. Тем самым была подсказана аналогия, позволившая построить ЭМ по законам волновой оптики. Х.Буш обнаружил, что с помощью электрических и магнитных полей можно формировать электронные изображения. В первые два десятилетия 20 в. были созданы и необходимые технические предпосылки. Промышленные лаборатории, работавшие над электронно-лучевым осциллографом, дали вакуумную технику, стабильные источники высокого напряжения и тока, хорошие электронные эмиттеры.
В 1931 Р.Руденберг подал патентную заявку на просвечивающий электронный микроскоп, а в 1932 М.Кнолль и Э.Руска построили первый такой микроскоп, применив магнитные линзы для фокусировки электронов. Этот прибор был предшественником современного ОПЭМ. (Руска был вознагражден за свои труды тем, что стал лауреатом Нобелевской премии по физике за 1986.) В 1938 Руска и Б. фон Боррис построили прототип промышленного ОПЭМ для фирмы «Сименс-Хальске» в Германии; этот прибор в конце концов позволил достичь разрешения 100 нм. Несколькими годами позднее А.Пребус и Дж.Хиллер построили первый ОПЭМ высокого разрешения в Торонтском университете (Канада).
Широкие возможности ОПЭМ почти сразу же стали очевидны. Его промышленное производство было начато одновременно фирмой «Сименс-Хальске» в Германии и корпорацией RCA в США. В конце 1940-х годов такие приборы стали выпускать и другие компании.
РЭМ в его нынешней форме был изобретен в 1952 Чарльзом Отли. Правда, предварительные варианты такого устройства были построены Кноллем в Германии в 1930-х годах и Зворыкиным с сотрудниками в корпорации RCA в 1940-х годах, но лишь прибор Отли смог послужить основой для ряда технических усовершенствований, завершившихся внедрением в производство промышленного варианта РЭМ в середине 1960-х годов. Круг потребителей такого довольно простого в обращении прибора с объемным изображением и электронным выходным сигналом расширился с быстротой взрыва. В настоящее время насчитывается добрый десяток промышленных изготовителей РЭМ’ов на трех континентах и десятки тысяч таких приборов, используемых в лабораториях всего мира. В 1960-х годах разрабатывались сверхвысоковольтные микроскопы для исследования более толстых образцов. Лидером этого направления разработок был Г.Дюпуи во Франции, где в 1970 был введен в действие прибор с ускоряющим напряжением, равным 3,5 млн. вольт. РТМ был изобретен Г.Биннигом и Г.Рорером в 1979 в Цюрихе. Этот весьма простой по устройству прибор обеспечивает атомное разрешение поверхностей. За свою работу по созданию РТМ Бинниг и Рорер (одновременно с Руской) получили Нобелевскую премию по физике. См. также КРИСТАЛЛЫ И КРИСТАЛЛОГРАФИЯ; МОЛЕКУЛ СТРОЕНИЕ; НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ; ФИЗИКА ТВЕРДОГО ТЕЛА; ВИРУСЫ.