Праймеры в пцр что это
Принцип ПЦР исследования
Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…
Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.
Как работает ПЦР?
Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.
Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.
Почему реакция называется полимеразная цепная?
В чём преимущества ПЦР?
Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:
ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:
Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:
Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:
Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:
Будьте здоровы и обследуйтесь в лаборатории, которой доверяете!
ПЦР: что это такое?
ВАЖНО!
Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.
Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.
Специфичность и применение
ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).
Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.
Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.
После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию
Словарь
Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.
Литература
ВАЖНО!
Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
ВАЖНО!
Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.
Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.
Специфичность и применение
ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).
Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.
Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.
После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию
Словарь
Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.
Литература
ВАЖНО!
Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
Полимеразная цепная реакция – руководство для начинающих
ПЦР — это метод современных лабораторий молекулярной биологии. Если вам нужно скопировать, упорядочить или количественно определить ДНК, вам необходимо знать ПЦР. Короче говоря, полимеразная цепная реакция — это биохимический метод, использующий термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК.
Эта статья дает краткий, базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут вам избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас. И даже если у вас есть опыт в ПЦР, стоит его немного освежить, и, возможно, получить один или два полезных совета.
Основные ингредиенты ПЦР:
Полимераза
Полимераза — это фермент, который при правильных условиях может собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была громоздкой, потому что высокие температуры, необходимые для денатурации ДНК, разрушали полимеразу. Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы необходимо было добавлять в реакцию вручную — дорогостоящее мероприятие. Эта проблема решена в современных методах, так как полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух термофильных источников, бактерий Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus. Эти полимеразы, соответственно, Taq (произносится «липкость») и Pfu (произносится «PFU»), легко выдерживают высокие температуры. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu спроектированы с учетом скорости, точности, способность завершать длительное чтение и читать шаблоны, богатые GC. Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на то, «что находится в вашем морозильнике», а ищите лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд. Также поговорите со своим местным торговым представителем, поскольку он часто может раздавать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.
Шаблон ДНК
Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша шаблонная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК. Чем более целостная и чистая ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР. Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно 1 пг — 1 нг плазмидной ДНК или 1 нг — 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.
Праймеры
Праймеры — это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей шаблонной ДНК. Вам нужно будет разработать один «прямой» праймер и один «обратный». Прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР. Последовательность этого праймера такая же, как у вашей ДНК-матрицы 5´-3´. Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратно комплементарной ДНК вашего шаблона. Обычно праймеры имеют длину 18-22 пары оснований. Однако важнее, чем их длина, является температура плавления ваших: она должна быть 54-60 ° С и максимально совпадать для обоих праймеров. Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитывать температуры отжига праймеров, и большинство компаний, которые синтезируют праймеры, предоставляют такие калькуляторы.
Нуклеотиды
Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий. В большинстве экспериментов вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP. Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания и оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP. Также убедитесь, что вы храните их правильно — не используйте морозильную камеру, которая проходит автоматические циклы размораживания.
Буфер
Большинство коммерческих полимераз поставляются с идеально подобранным буфером, который обеспечивает не только правильный рН, но и всегда содержит добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирование, ренатурирование и полимеразную активность ДНК.
Термоциклирование
Вот где происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляют в пробирку для ПЦР, которую затем термоциклируют. При изобретении ПЦР отдельные пробирки вручную перемещали между водяными банями с подогревом. Теперь, благодаря изобретению термоциклеров (или амплификаторов), регулирование температуры осуществляется автоматически. Ниже приведен типичный алгоритм работы амплификатора ПЦР:
На этом этапе реакцию нагревают до 94-96°С в течение от 30 секунд до нескольких минут. Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую полимеразу, и для денатурации вашей шаблонной ДНК.
На этом этапе смесь нагревают до 94-98°С в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжигать друг друга на следующем шаге.
На этом этапе температура вашей реакции быстро понижается до 50-64°C в течение 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы ваши денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований с вашей шаблонной ДНК. Но достаточно высокой, чтобы могли образовываться только самые стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже чем температура плавления вашей пары праймеров. Также на этом этапе ваша полимераза будет связываться с вашим комплексом ДНК праймер / матрица. Полимераза не начнет чтение, пока температура не повысится на следующем шаге.
На этом этапе реакционная смесь быстро нагревается до 72-80°C. В этот момент полимераза начинает чтение в направлении 5´-3´ и копировать ДНК шаблона в направлении 3´-5´. Более высокая температура на этом этапе уменьшает неспецифические взаимодействия ДНК праймера / матрицы, тем самым увеличивая специфичность реакции. Тем не менее, точная температура будет зависеть от предпочтения вашей полимеразы, поэтому перед экспериментом обязательно прочитайте инструкцию. Длина этого шага зависит от того, как долго будет длиться процесс копирования. Как правило, ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Поэтому вам нужно выдержать смесь как минимум 1 минуту для копирования 1000 пар оснований. В конце инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.
Затем шаги 2-4 повторяют 15-40 раз
Чем больше циклов вы проведете, тем больше копий ДНК вы получите. Тем не менее, есть верхний предел. В какой-то момент доступные свободные нуклеотиды становятся ограничивающими, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте. Лучше получить меньше чистого продукта ПЦР, нежели большое количество сильно загрязненного.
Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этом этапе реакцию проводят при 70-74°С в течение нескольких минут. Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на шаге элонгации. Этот шаг позволяет полимеразам завершить считывание того участка, на котором они находятся в данный момент. Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.
Ваша реакция теперь завершена. Поскольку весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводят в течение ночи. Рекомендуется запрограммировать ваш термоциклер на хранение продукта ПЦР при температуре 4°С до вашего возвращения. Советуем также прочесть статью о том, как провести ПЦР за 30 минут В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт, или перенести его в более подходящее долговременное хранилище, например, в холодильник.
Роспотребнадзор (стенд)
Роспотребнадзор (стенд)
ПЦР – диагностика. Просто о сложном
ПЦР – диагностика. Просто о сложном
С чего она начиналась. Конечно, с предшествующих открытий ДНК, принципа комплементарности, составляющих её аминокослот и использования фермента полимеразы для увеличения количества фрагментов лизированной ДНК.
Что такое – ПЦР – диагностика? ПЦР – это полимеразная цепная реакция. Из названия становится ясно, что основной компонент реакции – фермент полимераза, причем необходима термоустойчивая разновидность. Цепная реакция – это потому, что протекает она по типу ядерной реакции. В короткое время обеспечивается увеличение количества определяемой нуклеиновой кислоты в 2-4-8-16 и т. д. раз в геометрической прогрессии…
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR)изобрёл в 1983 году американский учёный Кэри Мюллис, работавший в области молекулярной биологии над созданием прибора под названием амплификатор.
Интересны обстоятельства, при которых у него появилась эта идея. Вот как это было… Открытию предшествовали размышления исследователя о проблеме разрушения обычной полимеразы в процессе воздействия высоких температур (до 95 град. С). В тёплую лунную майскую ночь биолог возвращался со своей дамой с дружеской вечеринки, девушка спала на заднем сидении кабриолета… Кэрри Мюллис вёл машину по пустынной дороге, освещенной лунным светом. И вот при таких романтических обстоятельствах у него появилась идея использовать полимеразу термоустойчивых бактерий, обитающих в термальных источниках!
В 1993 г. за воплощение в лабораторную практику молекулярной биологии этого изобретения он получил Нобелевскую премию.
В настоящее время ПЦР-диагностика является одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний, наследственных патологий, определения генетически модифицированных продуктов, идентичности биологического материала, в том числе в судебной практике.
ПЦР – диагностика стала необходимым элементом при постановке диагноза вирусных гепатитов В и С, назначении лечения интерферонами и его корректировке по дозам и срокам специфического лечения.
Различают методы ПЦР: с учётом по конечной точке методом электрофореза, флюоресцентной детекции на приборах «АЛА 1\4» (Латвия), «Джин» ( Россия), полуколичественный метод, и самый современный метод – в режиме реального времени с использованием надёжного специального оборудования.
Эпидемии гриппа А Н1N1 (Калифорния 09) 2009 г. и прошедшего эпидсезона 2015-2016 годов показали, что Роспотребнадзор по Республике Дагестан успешно справился с задачей диагностики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций у больных с тяжёлыми формами респираторной патологии.
ПЦР – диагностика с помощью мультиплексных тест-систем (на несколько инфекций) с успехом используется не только в диагностике ОРВИ, пневмоний, менингитов, а также для расшифровки вспышек пищевых токсикоинфекций, как на бактерии, так и на вирусы.